Bigger and Better Photons: The Road to Great FLIM?Results
原文鏈接 by Wolfgang Becker
翻譯 by 譚瓅
摘要：這篇文章試圖幫助bh FLIM技術的現有和未來用戶從FLIM實驗中獲得最佳結果。第一部分解釋了TCSPC FLIM的原理，并給出了記錄的光子分布的效果。它表明，測量壽命的信噪比在優先取決于記錄的光子數量。第二部分重點介紹優化光子數，而不增加施加到樣品中的光應力。我們討論了激發功率、采集時間、采集效率、數值孔徑、聚焦精度、對準精度和探測器效率的影響。第三部分將重點介紹光子效率。它考慮了TCSPC計時參數、計數背景、像素數、儀器響應函數的影響，以及多指數衰減函數的挑戰。最后一部分專門介紹數據分析。本文中的所有結論均通過在實際條件下記錄的真實測量數據進行演示。
優質的FLIM圖像
圖1：BPAE樣品的FLIM圖像，2048 x 2048像素，衰減函數記錄在256個時間通道中。采用bh DCS-120 共聚焦 FLIM 系統，bh SPCImage FLIM 數據分析軟件。
是什么造就了一個好的FLIM圖像？它應該具有完美的空間分辨率、足夠高的像素數、高對比度、低背景噪聲，沒有失焦模糊，并且它應該以高信噪比顯示熒光壽命。如上圖所示。有經驗的FLIM用戶可能會補充說，僅僅記錄熒光壽命是不夠的，整個衰減函數應該記錄在每個像素中。
為什么發表在科學論文中的FLIM圖像很少看起來像上面的圖像？這實際上沒有任何理由。所有要做的就是使用完美對準的光學元件，正確的顯微物鏡，完美的聚焦，正確的激發和探測波長，正確的探測器以及一點點耐心。對FLIM的信號處理原理的一些理解也可能有所幫助，這些是每個FLIM用戶都可以實現的。
本文介紹了獲得出色的 FLIM 結果的重要因素，給出的大多數建議都是微不足道的。然而，差之毫厘，失之千里，正是這些瑣碎事物的總和，使得完美的FLIM結果區別于平庸的FLIM結果。
第一部分：TCSPC FLIM結果是光子的分布
TCSPC FLIM原理
追求完美FLIM結果的道路始于理解TCSPC FLIM結果是光子的分布，參考文獻[1]。記錄過程的基本原理如圖2所示。
通過高頻脈沖激光束掃描樣品，探測器探測發射的熒光單光子，并由TCSPC系統測量激光脈沖周期內每個光子的到達時間t。同時，TCSPC系統確定激光束在光子探測時刻的空間坐標x，y。從這些數據中，光子在空間坐標上和時間上的分布被建立起來。這種光子分布是期望的壽命圖像：它是x*y像素的數據陣列，每個像素都包含大量連續時間通道中的熒光衰減函數。參見圖 2右。記錄過程及其各種擴展的詳細說明可以在文獻[2]中找到。
圖2：TCSPC FLIM原理
圖3給出了FLIM記錄的光子分布的效果。該圖顯示了 8 個水平 x 128 垂直像素的圖像區域。每個像素有256個時間通道，包含該像素的衰減數據。當然，真實的FLIM圖像具有更高的像素數。常規FLIM為采用256至1024個時間通道的512 x512像素的格式，并且已經演示過采用256個時間通道的2048 x 2048像素的格式，參考文獻[2]。
對于沒有經驗的用戶來說，圖3中所示的分布可能看起來非常“嘈雜”：單個像素中的熒光衰減幾乎看不見。當然，這些“噪聲”不是由探測器或TCSPC電子設備的任何噪聲引起的，它只是一種光子統計的效應，噪聲如此之高的原因是光子分布在大量的像素和時間通道上。因此，每個像素的光子數都很低，特別是在每個像素中各個時間通道中的光子數更低。那么，如何降低光子分布中的“噪聲”呢？唯一的方法是記錄更多的光子，見圖4。
圖3：TCSPC FLIM的光子分布。該圖表示 X × Y = 8 × 128 像素的圖像區域，每個像素有256個時間通道，每個時間通道都包含熒光衰減周期內連續時間的光子。
圖4：與圖3所示的光子分布相同，但記錄的光子多10倍，信噪比高出3.1倍，單個像素中的熒光衰減曲線清晰突出。
信噪比——SNR
從這些數據中得出的熒光壽命的信噪比是多少？我們從一個簡單的實驗中獲得答案。
根據定義，熒光壽命τ是分子保持在激發態的平均時間。當一個分子發出一個光子時，這意味著它從激發態返回基態。FLIM系統探測單個光子并測量它們相對于激發脈沖的時間t，如圖5 a和b。當FLIM系統探測到大量這樣的光子時，它們在激發脈沖后到達探測器的平均時間是分子處于激發態的平均時間，即為熒光壽命，見圖5 c。雖然FLIM硬件通常不直接計算平均到達時間，但它存在于光子分布中。
圖5，a和b：光子的探測和激發后一段時間（t）內光子隨時間的分布. c：探測N光子后的光子分布，激發后的平均到達時間<t>是熒光壽命τ. d：到達時間（t）的標準差σt，是熒光壽命τ。平均到達時間的標準差 στ 為 τ /SQRT(N).
平均到達時間的信噪比是多少？單個光子到達時間的標準偏差στ與熒光壽命τ本身相同，這是指數函數的性質。如果我們平均大量（ N 個）光子的到達時間，則結果的標準偏差στ隨N的平方根而減小，請參見圖5，d。因此，探測到N個光子后的信噪比，即τ除以其標準偏差στ的比值為：
SNRτ = τ / στ = SQRT (N)
這意味著可以獲得熒光壽命的標準偏差只是衰減曲線中光子數量的平方根，參考文獻[17]，這在幾個方面是一個了不起的結果。首先，像素壽命的信噪比與像素強度的信噪比相同，這否定了FLIM比穩態成像需要更多的光子（因此需要更多的采集時間）的普遍觀點。其次，信噪比僅取決于N，特別是，不依賴于記錄熒光衰減的時間通道數。換句話說，您可以增加時間通道的數量，以提高時間分辨率或減少采樣偽影，而不會影響信噪比。第三，由于SNR僅依賴于N，因此提高壽命精度的唯一方法是增加N。這意味著你要么必須減少像素的數量 – 你通常不希望 – 或者記錄更多的光子。記錄更多光子是獲得良好FLIM結果的關鍵，也是下一部分的主題。
光子分布的一階矩
如上所述，單指數衰減（或單指數衰減近似）的熒光壽命可以通過計算光子的平均到達時間來獲得。如果光子的單個到達時間不可用，則可以通過從完整的光子分布中計算“一階矩” M1 （參考文獻[18]）獲得平均到達時間：
上述等式中的時間t，是光子在FLIM系統的觀測時間間隔內的時間，而不是從激發脈沖之后的時間。因此，必須減去激發時間（在實踐中是IRF的一階矩）才能得到熒光壽命τ：
τ = M1fluorescence ?M1IRF
該方法如圖2所示。藍點是各個時間通道中的光子數，綠色曲線是IRF，紅色曲線是通過用IRF卷積指數函數e-t/τ來計算的假設熒光衰減函數。
圖6：熒光壽命的一階矩計算，熒光壽命是熒光的一階矩和IRF的一階矩的差值。
一階矩技術以理想的信噪比提供單指數衰減的時間。但是，它不會提供多指數衰減函數的參數，并且如果記錄包含背景計數，或只有一部分衰減函數位于TCSPC系統的觀測時間間隔內，則它不會提供正確的衰減時間。因此，它幾乎完全被曲線擬合技術所取代。然而，一階矩技術有其優點：它可在非常低的光子數下可靠地工作，適用于在線FLIM應用中的快速壽命測定，最重要的是，它提供了一種在理想和非理想條件下估計FLIM信噪比的方法。我們將在本文的后面部分使用到此方法。
SQRT（N）關系的實驗驗證如圖7所示。以不同的采集時間掃描染料溶液，以獲得每像素包含約200，1600和9000個光子的FLIM圖像。典型的衰減曲線如圖7的頂行所示。第二行顯示了單個像素中熒光壽命的直方圖，它是用一階矩分析獲得的，στ 值和σ/τ = SNR 值在直方圖中顯示。從這些值可以看出，σ/τ確實非常接近于SQRT（N）。圖 7 的底行顯示了通過 MLE（最大似然估計）擬合獲得的壽命直方圖。從MLE擬合獲得的壽命直方圖比從矩分析中獲得的直方圖要寬一些，而且MLE結果也接近SQRT（N）的理想信噪比。
圖 7：SQRT （N） 關系的驗證。頂行：來自羅丹明110染料溶液的FLIM數據單個像素的衰減曲線。從左到右：N = 200個光子，N = 1600個光子，N = 9000個光子。第二行：通過一階矩方法分析獲得的壽命直方圖。底行：通過 MLE 分析獲得的壽命直方圖。
光子效率
探測到光子并不一定意味著它有效地有助于壽命測量的準確性。它可能因TCSPC模塊中不適宜地選擇的計時參數而丟失，其探測時間可能因探測器傳輸時間的不確定性而受損，或者可能存在來自背景信號的光子給光子分布增加額外的噪聲。在所有這些情況下，獲得的壽命的SNR都小于理想值SQRT（N）。這種情況可以用“光子效率”E來描述。E的倒數表示與理想系統相比，非理想系統需要多少光子才能達到相同的信噪比。由于SNR與光子數的平方根成比例，光子效率也可以寫為
E = (SNRreal / SNRideal)2
光子效率E是“品質因數”的平方，有時用于比較不同壽命測量技術的效率（參考文獻[10，16]）。正確配置的TCSPC系統在最佳條件下工作，其光子效率接近1，達到理想的光子效率將是“最大化光子效率”這一部分的主題。
References
1. W. Becker, Advanced time-correlated single-photon counting techniques. Springer, Berlin, Heidelberg, New York,2005
2. W. Becker, The bh TCSPC handbook, 8th edition. Becker & Hickl GmbH (2019), available online on www.becker-hickl.com. Please contact bh for printed copies.
3. SPCImage NG data analysis software. In: W. Becker, The bh TCSPC handbook, 8th edition. Becker & Hickl GmbH(2019)
4. W. Becker (ed.), Advanced time-correlated single photon counting applications. Springer, Berlin, Heidelberg, New York (2015)
5. Becker & Hickl GmbH, DCS-120 Confocal and Multiphoton Scanning FLIM Systems, user handbook 87th ed. (2019).?Available on www.becker-hickl.com
6. Becker & Hickl GmbH, Modular FLIM systems for Zeiss LSM 510 and LSM 710 family laser scanning microscopes.?User handbook. Available on www.becker-hickl.com
7. Becker & Hickl GmbH, FLIM systems from Zeiss LSM 980 Laser scanning microscopes, addendum to modular FLIM?systems for Zeiss LSM 510 and LSM 710 family laser scanning microscopes. Available on www.becker-hickl.com
8. Fast-Acquisition TCSPC FLIM: What are the Options? Application note, available from www.becker-hickl.com
9. W. Becker, V. Shcheslavkiy, S. Frere, I. Slutsky, Spatially Resolved Recording of Transient Fluorescence-Lifetime?Effects by Line-Scanning TCSPC. Microsc. Res. Techn. 77, 216-224 (2014)
10. R.M. Ballew, J.N. Demas, An error analysis of the rapid lifetime determination method for the evaluation of single?exponential decays, Anal. Chem. 61, 30 (1989)
11. W. Becker, B. Su, K. Weisshart, O. Holub, FLIM and FCS Detection in Laser-Scanning Microscopes: Increased?Efficiency by GaAsP Hybrid Detectors. Micr. Res. Tech. 74, 804-811 (2011)
12. Wolfgang Becker, Cornelia Junghans, Axel Bergmann, Two-photon FLIM of mushroom spores reveals ultra-fast decay component. Application note, available on www.becker-hickl.com.
13. Becker & Hickl GmbH, Ultra-fast HPM detectors improve NADH FLIM. Application note, www.becker-hickl.com
14. Becker & Hickl GmbH, Two-Photon FLIM with a Femtosecond Fibre Laser. Application note, www.becker-hickl.com
15. Becker Wolfgang, Suarez-Ibarrola Rodrigo, Miernik Arkadiusz, Braun Lukas, Metabolic Imaging by Simultaneous?FLIM of NAD(P)H and FAD. Current Directions in Biomedical Engineering 5(1), 1-3 (2019)
16. H.C. Gerritsen, M.A.H. Asselbergs, A.V. Agronskaia, W.G.J.H.M. van Sark, Fluorescence lifetime imaging in?scanning microscopes: acquisition speed, photon economy and lifetime resolution, J. Microsc. 206, 218-224 (2002)
17. M. K?llner, J. Wolfrum, How many photons are necessary for fluorescence-lifetime measurements?, Phys. Chem. Lett.?200, 199-204 (1992)
18. I. Isenberg, R.D. Dyson, The analysis of fluorescence decay by a method of moments. Biophys. J. 9, 1337-1350 (1969)
