雙光子激發(fā)熒光的優(yōu)勢(shì)就是相比共聚焦使用更長(zhǎng)的波長(zhǎng)，所以對(duì)于組織而言有著更小的傷害，同時(shí)，穿透力更深！共聚焦的成像深度普遍在100μm，而雙光子可以達(dá)到250μm-500μm，有些甚至能夠達(dá)到1mm。另外，同時(shí)吸收雙光子僅僅在一個(gè)焦點(diǎn)處，所以不會(huì)損傷焦平面以外的組織，并且成像更清晰！
更短的脈沖會(huì)產(chǎn)生更亮的信號(hào)
多光子和高次諧波等非線性依賴于脈沖激光峰值功率。峰值功率的提高，增加了同時(shí)發(fā)生多光子吸收的概率。例如雙光子熒光與三光子熒光信號(hào)分別與入射光強(qiáng)度的平方和三次方成比例。對(duì)于激光器峰值功率的增加，相應(yīng)的激發(fā)熒光信號(hào)隨之增加。低于50fs的脈沖寬度能夠明顯提高多光子效率和高次諧波產(chǎn)生效率，進(jìn)而明顯提高成像質(zhì)量（亮度）。如下圖所示，展示了雙光子（SHG）和三光子（THG）信號(hào)強(qiáng)度與脈沖持續(xù)時(shí)間[1,2](SHG強(qiáng)度-1/τ)之間的關(guān)系。
值得一提的是，如果顯微鏡光學(xué)器件中的色散沒(méi)有得到適當(dāng)補(bǔ)償，脈沖將被拉伸，并且將在樣品處測(cè)量較低的峰值功率。在這種情況下，脈沖持續(xù)時(shí)間和高次諧波產(chǎn)生效率之間的關(guān)系無(wú)法通過(guò)實(shí)驗(yàn)精確驗(yàn)證。為了產(chǎn)生足夠的非線性SHG和THG信號(hào)，以在對(duì)樣本溫和的平均功率水平下實(shí)現(xiàn)所需的信噪比，50 fs以下的脈沖和色散預(yù)補(bǔ)償?shù)氖褂檬潜夭豢缮俚摹?/p>
50fs光纖飛秒激光器——VALO系列
雙光子吸收和頻產(chǎn)生非線性過(guò)程，這要求及其強(qiáng)的電場(chǎng)強(qiáng)度，而電場(chǎng)取決于聚焦光斑的大小和激光器脈寬。聚焦光斑越小、脈寬越窄、雙光子吸收效率越高！
基于光纖激光器——VALO，其具有靈活性、易用性和低維護(hù)成本。是現(xiàn)代雙光子成像領(lǐng)域得力光源！緊湊型VALO Aalto和VALO Tidal激光器以30MHz的重復(fù)頻率提供＜50fs的脈沖，單脈沖能量分別是6.6nJ與66nJ，平均功率分別為200mW與2000mW。光束質(zhì)量無(wú)對(duì)準(zhǔn)的高質(zhì)量光束（Aalto的典型M2＜1.1，Tidal的典型M2＜1.2）并且集成了色散預(yù)補(bǔ)償模塊。
VALO飛秒激光器采用被動(dòng)冷卻方式、不需要水冷與風(fēng)冷散熱。并且前面提及，超短脈沖和更好的光束質(zhì)量，可以擁有更高的光子轉(zhuǎn)換效率、并且較低的平均功率對(duì)于觀察活體細(xì)胞而言，對(duì)細(xì)胞或組織的損傷更低。
VALO系列飛秒光纖激光器
<50 fs 脈沖持續(xù)時(shí)間
高達(dá) 2 W 的輸出功率
極低的噪音
集成預(yù)補(bǔ)償色散模塊
應(yīng)用實(shí)例1
長(zhǎng)時(shí)間觀察活體細(xì)胞過(guò)程中，光損傷是限制因素之一。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中高平均功率的持續(xù)照射對(duì)細(xì)胞本身產(chǎn)生很大影響。不過(guò)，對(duì)光毒性敏感的活細(xì)胞來(lái)說(shuō)，低平均功率、小于50fs的脈沖寬度、極高的峰值功率，既減少了對(duì)細(xì)胞的損傷、又大大延長(zhǎng)了成像時(shí)間。
例如下表統(tǒng)計(jì)所示：VALO 50fs與傳統(tǒng)200fs進(jìn)行比較，同峰值功率只需要輸出1/4的激光功率，換句話來(lái)講，成像相同質(zhì)量情況下，成像效率是傳統(tǒng)200fs激光光源的4倍！同時(shí)，相比傳統(tǒng)200fs而言，還能擁有更長(zhǎng)的成像時(shí)間，為了降低光毒性的影響，更低的重復(fù)頻率光源是首選。總的來(lái)說(shuō)，VALO激光器具備這樣的優(yōu)勢(shì)條件。
| 脈沖寬度 | 峰值功率（30MHz） | 平均功率 |
| 200fs | 16KW | 100mW |
| 50fs | 16KW | 25mW |
VALO激光器與傳統(tǒng)激光器參數(shù)對(duì)比
下圖顯示了使用VALO系列＜50fs脈沖激光器在沒(méi)有組織損傷的情況下進(jìn)行髓鞘形態(tài)的多光子成像和長(zhǎng)時(shí)間延時(shí)采集(超過(guò)一小時(shí))。觀察到脫軸和脫軸髓鞘膜可以研究鈉離子通道在多發(fā)性硬化(MS)疾病中的作用。
隨著鈉離子濃度持續(xù)提高，進(jìn)而誘導(dǎo)髓鞘腫脹 得到的延時(shí)成像
應(yīng)用實(shí)例2
如下圖所示，顯示了來(lái)自校準(zhǔn)網(wǎng)格的三次諧波信號(hào)，樣品的平均功率為4.7mW，具有VALO系列飛秒激光器的全帶寬，產(chǎn)生約40fs脈沖。在圖b）中，激光器的光譜帶寬被限制在1064nm附近的10nm FWHM，產(chǎn)生約160 fs的脈沖。圖a）和圖b）中的圖像具有相同的比例，但圖b）中沒(méi)有顯示THG信號(hào)。只有在從較長(zhǎng)的~160fs脈沖中重新縮放較低的THG信號(hào)后，才有可能獲得高于實(shí)驗(yàn)噪聲基底的圖像，如圖c）所示。在這種情況下，需要高2.5倍的平均激光功率來(lái)實(shí)現(xiàn)與從較短的50 fs以下脈沖獲得的THG信號(hào)的信噪比相當(dāng)?shù)男旁氡葋?lái)實(shí)現(xiàn)。總之，小于50fs脈沖提供了相當(dāng)高的脈沖峰值功率，這導(dǎo)致了在低得多的平均功率下的最佳信噪比圖像，這反過(guò)來(lái)減少了光漂白，并延長(zhǎng)了細(xì)胞活力。
50μm2的校準(zhǔn)網(wǎng)格(ibidi) 的三次諧波。
a)47mW，全譜短脈沖 (<50fs;VALO系列)
b)6mW 光光譜限制在10nm帶寬 (~160fs)
c)6mw的激光光譜限制在10nm帶寬(~160fs)
展望
多光子顯微鏡在各種應(yīng)用中具有巨大的潛力，包括開(kāi)發(fā)未來(lái)的診斷篩查系統(tǒng)。VALO系列飛秒激光器在50 fs以下范圍內(nèi)提供脈沖，并提供前所未有的多光子轉(zhuǎn)換效率和強(qiáng)大的峰值功率。這反過(guò)來(lái)又有助于推動(dòng)無(wú)標(biāo)簽多光子應(yīng)用的前沿，特別是在三次諧波成像中，因?yàn)樗軌驅(qū)崿F(xiàn)高靈敏度的擴(kuò)展活細(xì)胞成像和延時(shí)測(cè)量。
參考文獻(xiàn)
[1] Shuo Tang, Tatiana Krasieva, Zhongping Chen, Gabriel Tempea, Bruce Tromberg (2006), Effect of pulse duration on two-photon excited fluorescence and second harmonic generation in nonlinear optical
microscopy, Journal of Biomedical Optics, 11(2).
[2] Mira Sibai, Hussein Mehidine, Fanny Poulon, Ali Ibrahim, M. Juchaux, J. Pallud, A. Kudlinski, Darine Haidar (2018), The Impact of Compressed Femtosecond Laser Pulse Durations on Neuronal Tissue Used for Two-
Photon Excitation Through an Endoscope, Scientific Reports, 8:11124.
[3] G.M Hale and M. R. Querry (1973), Optical Constants of Water in the 200-nm to 200-microm Wavelength Region, Appl. Opt., 12, 555-563.
[4] Gert-Jan Bakker, Sarah Weischer , Júlia Ferrer Ortas, Judith Heidelin, Volker Andresen, Marcus Beutler, Peter Friedl (2022), Intravital Deep-Tumor Single-Beam 2-, 3- and 4-Photon Microscopy, eLife 11.
[5] K. Giering , O. Minet , I. Lamprecht , G. Müller (1995), Review of thermal properties of biological tissues, SPIE PM, 25, 45-65.
[6] Stephen A. Boppart, Sixian You, Lianhuang Li, Jianxin Chen, and Haohua Tu (2019), Simultaneous label-free utofluorescence-multiharmonic microscopy and beyond, cAPL Photon 4.
