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]]>與使用TAC/ADC原理的SPC-130、-150、-160和-180 TCSPC模塊不同,SPC-QC系列使用直接時(shí)間數(shù)字(TDC)轉(zhuǎn)換,下圖說(shuō)明了這兩種轉(zhuǎn)換方式的原理。

TAC/ADC原理如左圖所示:它使用起始脈沖(通常是光子通道)和停止脈沖(通常是來(lái)自激光的參考脈沖)之間的線性電壓斜坡定時(shí),電壓差值轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào),該信號(hào)表示激光脈沖序列中光子的時(shí)間。
TDC原理如右圖所示:來(lái)自探測(cè)器的光子脈沖和來(lái)自激光的參考脈沖分別被送入延遲單元鏈。時(shí)序邏輯查看延遲鏈中的數(shù)據(jù),識(shí)別光子和激光脈沖的啟動(dòng)-停止對(duì),并以這種方式確定光子在激光脈沖序列中的時(shí)間位置。從這些數(shù)據(jù)中,建立起TCSPC/FLIM的光子分布。
TDC原理的優(yōu)點(diǎn)是,定時(shí)電子可以在FPGA(現(xiàn)場(chǎng)可編程門陣列)中實(shí)現(xiàn),因此,可以在一個(gè)TCSPC板上實(shí)現(xiàn)多個(gè)記錄通道。TDC優(yōu)于TAC的另一個(gè)特點(diǎn)是,TDC原理可以達(dá)到極高的計(jì)數(shù)率,甚至每個(gè)激光脈沖可能檢測(cè)到幾個(gè)光子。在實(shí)踐中,計(jì)數(shù)率受到堆疊、探測(cè)器-鑒別器組合中的死時(shí)間、高計(jì)數(shù)率下探測(cè)器定時(shí)性能的下降,當(dāng)然,還受到樣品提供計(jì)數(shù)率的能力的限制。
缺點(diǎn)是,時(shí)間分辨率遠(yuǎn)低于TAC/ADC原理。下圖,SPC-180NXX和SPC-QC-104的電子IRF進(jìn)行了比較。SPC-180NXX(左)的IRF寬度為2.8 ps FWHM,SPC-QC-104(右)的IRF寬度為39 ps FWHM。雖然39 ps FWHM對(duì)TDC來(lái)說(shuō)還算不錯(cuò),但SPC-QC-104沒(méi)有利用超快探測(cè)器的全時(shí)分辨率,如SSPD、MCP-PMT和超快混合型PMT探測(cè)器。

另一個(gè)關(guān)鍵差異是定時(shí)穩(wěn)定性,多年來(lái),定時(shí)穩(wěn)定性一直是TDC的一個(gè)問(wèn)題。在SPC-QC-104中,穩(wěn)定性問(wèn)題在很大程度上已被新的TDC邏輯結(jié)構(gòu)所克服。下圖顯示了SPC-180 NXX和SPC-QC-104的定時(shí)穩(wěn)定性的比較:對(duì)于SPC-180 NXX,IRF第一矩的穩(wěn)定性優(yōu)于0.4 ps RMS,對(duì)于SPC-QC-104,它優(yōu)于5 ps RMS(注意不同的時(shí)間尺度)。雖然SPC-QC沒(méi)有達(dá)到SPC-180NXX的穩(wěn)定性,但可能的定時(shí)漂移仍然遠(yuǎn)低于IRF寬度,因此在實(shí)際應(yīng)用中很少是一個(gè)問(wèn)題。

結(jié)論
SPC-QC-104是基于TDC的TCSPC FLIM模塊,它有三個(gè)并行的TCSPC/FLIM通道和一個(gè)通用參考通道。或者,這些模塊可以作為四個(gè)并聯(lián)的絕對(duì)光子定時(shí)通道進(jìn)行操作。該模塊具有高峰值計(jì)數(shù)率和相當(dāng)快的時(shí)間分辨率。SPC-QC-104的電子IRF寬度<39 ps FWHM,內(nèi)部定時(shí)抖動(dòng)<19 ps RMS,定時(shí)穩(wěn)定性為5 ps RMS,可用于大部分熒光衰減和FLIM應(yīng)用。SPC-QC-104在需要多個(gè)并行檢測(cè)通道的應(yīng)用中特別有優(yōu)勢(shì),SPC-150或-180模塊的多模塊系統(tǒng)似乎過(guò)于笨重或耗電。缺點(diǎn)是,SPC-QC-104沒(méi)有利用超快單光子探測(cè)器的全時(shí)分辨率,如SSPD、MCP-PMT或混合型PMT。在具有此類探測(cè)器的應(yīng)用中,應(yīng)使用bh SPC系列,最好使用SPC-180NX或SPC-180NXX。
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]]>The post bh Express-FLIM系統(tǒng)以近視頻速度運(yùn)行 appeared first on 深圳市檀臻科技有限公司.
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]]>The post HüBNER VALO系列飛秒激光器在多光子成像中的應(yīng)用 appeared first on 深圳市檀臻科技有限公司.
]]>多光子和高次諧波等非線性依賴于脈沖激光峰值功率。峰值功率的提高,增加了同時(shí)發(fā)生多光子吸收的概率。例如雙光子熒光與三光子熒光信號(hào)分別與入射光強(qiáng)度的平方和三次方成比例。對(duì)于激光器峰值功率的增加,相應(yīng)的激發(fā)熒光信號(hào)隨之增加。低于50fs的脈沖寬度能夠明顯提高多光子效率和高次諧波產(chǎn)生效率,進(jìn)而明顯提高成像質(zhì)量(亮度)。如下圖所示,展示了雙光子(SHG)和三光子(THG)信號(hào)強(qiáng)度與脈沖持續(xù)時(shí)間[1,2](SHG強(qiáng)度-1/τ)之間的關(guān)系。

值得一提的是,如果顯微鏡光學(xué)器件中的色散沒(méi)有得到適當(dāng)補(bǔ)償,脈沖將被拉伸,并且將在樣品處測(cè)量較低的峰值功率。在這種情況下,脈沖持續(xù)時(shí)間和高次諧波產(chǎn)生效率之間的關(guān)系無(wú)法通過(guò)實(shí)驗(yàn)精確驗(yàn)證。為了產(chǎn)生足夠的非線性SHG和THG信號(hào),以在對(duì)樣本溫和的平均功率水平下實(shí)現(xiàn)所需的信噪比,50 fs以下的脈沖和色散預(yù)補(bǔ)償?shù)氖褂檬潜夭豢缮俚摹?/p>
雙光子吸收和頻產(chǎn)生非線性過(guò)程,這要求及其強(qiáng)的電場(chǎng)強(qiáng)度,而電場(chǎng)取決于聚焦光斑的大小和激光器脈寬。聚焦光斑越小、脈寬越窄、雙光子吸收效率越高!
基于光纖激光器——VALO,其具有靈活性、易用性和低維護(hù)成本。是現(xiàn)代雙光子成像領(lǐng)域得力光源!緊湊型VALO Aalto和VALO Tidal激光器以30MHz的重復(fù)頻率提供<50fs的脈沖,單脈沖能量分別是6.6nJ與66nJ,平均功率分別為200mW與2000mW。光束質(zhì)量無(wú)對(duì)準(zhǔn)的高質(zhì)量光束(Aalto的典型M2<1.1,Tidal的典型M2<1.2)并且集成了色散預(yù)補(bǔ)償模塊。

VALO飛秒激光器采用被動(dòng)冷卻方式、不需要水冷與風(fēng)冷散熱。并且前面提及,超短脈沖和更好的光束質(zhì)量,可以擁有更高的光子轉(zhuǎn)換效率、并且較低的平均功率對(duì)于觀察活體細(xì)胞而言,對(duì)細(xì)胞或組織的損傷更低。
<50 fs 脈沖持續(xù)時(shí)間
高達(dá) 2 W 的輸出功率
極低的噪音
集成預(yù)補(bǔ)償色散模塊
長(zhǎng)時(shí)間觀察活體細(xì)胞過(guò)程中,光損傷是限制因素之一。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中高平均功率的持續(xù)照射對(duì)細(xì)胞本身產(chǎn)生很大影響。不過(guò),對(duì)光毒性敏感的活細(xì)胞來(lái)說(shuō),低平均功率、小于50fs的脈沖寬度、極高的峰值功率,既減少了對(duì)細(xì)胞的損傷、又大大延長(zhǎng)了成像時(shí)間。
例如下表統(tǒng)計(jì)所示:VALO 50fs與傳統(tǒng)200fs進(jìn)行比較,同峰值功率只需要輸出1/4的激光功率,換句話來(lái)講,成像相同質(zhì)量情況下,成像效率是傳統(tǒng)200fs激光光源的4倍!同時(shí),相比傳統(tǒng)200fs而言,還能擁有更長(zhǎng)的成像時(shí)間,為了降低光毒性的影響,更低的重復(fù)頻率光源是首選。總的來(lái)說(shuō),VALO激光器具備這樣的優(yōu)勢(shì)條件。
| 脈沖寬度 | 峰值功率(30MHz) | 平均功率 |
| 200fs | 16KW | 100mW |
| 50fs | 16KW | 25mW |
VALO激光器與傳統(tǒng)激光器參數(shù)對(duì)比
下圖顯示了使用VALO系列<50fs脈沖激光器在沒(méi)有組織損傷的情況下進(jìn)行髓鞘形態(tài)的多光子成像和長(zhǎng)時(shí)間延時(shí)采集(超過(guò)一小時(shí))。觀察到脫軸和脫軸髓鞘膜可以研究鈉離子通道在多發(fā)性硬化(MS)疾病中的作用。

隨著鈉離子濃度持續(xù)提高,進(jìn)而誘導(dǎo)髓鞘腫脹 得到的延時(shí)成像
如下圖所示,顯示了來(lái)自校準(zhǔn)網(wǎng)格的三次諧波信號(hào),樣品的平均功率為4.7mW,具有VALO系列飛秒激光器的全帶寬,產(chǎn)生約40fs脈沖。在圖b)中,激光器的光譜帶寬被限制在1064nm附近的10nm FWHM,產(chǎn)生約160 fs的脈沖。圖a)和圖b)中的圖像具有相同的比例,但圖b)中沒(méi)有顯示THG信號(hào)。只有在從較長(zhǎng)的~160fs脈沖中重新縮放較低的THG信號(hào)后,才有可能獲得高于實(shí)驗(yàn)噪聲基底的圖像,如圖c)所示。在這種情況下,需要高2.5倍的平均激光功率來(lái)實(shí)現(xiàn)與從較短的50 fs以下脈沖獲得的THG信號(hào)的信噪比相當(dāng)?shù)男旁氡葋?lái)實(shí)現(xiàn)。總之,小于50fs脈沖提供了相當(dāng)高的脈沖峰值功率,這導(dǎo)致了在低得多的平均功率下的最佳信噪比圖像,這反過(guò)來(lái)減少了光漂白,并延長(zhǎng)了細(xì)胞活力。

50μm2的校準(zhǔn)網(wǎng)格(ibidi) 的三次諧波。
a)47mW,全譜短脈沖 (<50fs;VALO系列)
b)6mW 光光譜限制在10nm帶寬 (~160fs)
c)6mw的激光光譜限制在10nm帶寬(~160fs)
多光子顯微鏡在各種應(yīng)用中具有巨大的潛力,包括開(kāi)發(fā)未來(lái)的診斷篩查系統(tǒng)。VALO系列飛秒激光器在50 fs以下范圍內(nèi)提供脈沖,并提供前所未有的多光子轉(zhuǎn)換效率和強(qiáng)大的峰值功率。這反過(guò)來(lái)又有助于推動(dòng)無(wú)標(biāo)簽多光子應(yīng)用的前沿,特別是在三次諧波成像中,因?yàn)樗軌驅(qū)崿F(xiàn)高靈敏度的擴(kuò)展活細(xì)胞成像和延時(shí)測(cè)量。
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]]>The post bh公司發(fā)布第十版TCSPC Handbook appeared first on 深圳市檀臻科技有限公司.
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共1038頁(yè),涵蓋了經(jīng)典和多維TCSPC技術(shù)的一般原理,各類探測(cè)器的描述及其相關(guān)原理,以及它們?cè)诟鞣N實(shí)驗(yàn)設(shè)置下可達(dá)到的性能的概述。
手冊(cè)的一個(gè)大的部分涵蓋了TCSPC在典型的時(shí)間分辨光譜實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用,它描述了熒光和各向異性衰減曲線的測(cè)量,多光譜壽命實(shí)驗(yàn),瞬態(tài)熒光壽命現(xiàn)象的記錄,磷光衰減曲線的測(cè)量,F(xiàn)LIM與各種激發(fā)原理,高速和時(shí)間序列FLIM,Z堆棧FLIM,熒光和磷光壽命同時(shí)成像(FLIM/PLIM)、FLITS和搭配特殊顯微鏡配置的FLIM。
手冊(cè)的另一部分涵蓋了TCSPC應(yīng)用,它包含關(guān)于分子成像,F(xiàn)RET實(shí)驗(yàn),自體熒光成像,新陳代謝成像,臨床FLIM,近紅外光譜儀和fNIRS技術(shù),相關(guān)測(cè)量實(shí)驗(yàn),單分子光譜和FCS的章節(jié)。
本手冊(cè)還包含說(shuō)明bh的SPCImage NG數(shù)據(jù)分析軟件的章節(jié)。最后列出了1368個(gè)與TCSPC相關(guān)的參考文獻(xiàn),其中大部分是BH SPC計(jì)數(shù)器的應(yīng)用。
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]]>The post 檀臻科技產(chǎn)品手冊(cè)V2023.09 appeared first on 深圳市檀臻科技有限公司.
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點(diǎn)擊圖片下載產(chǎn)品手冊(cè)
檀臻科技專注于弱光探測(cè),合作世界先進(jìn)光電儀器及元器件廠商,服務(wù)于生物光子學(xué)、物理與光學(xué)、化學(xué)、材料、納米科學(xué)和高能探測(cè)等領(lǐng)域,為科研院所、高校和高科技企業(yè)提供先進(jìn)的產(chǎn)品、解決方案以及技術(shù)支持。
檀臻科技最新產(chǎn)品手冊(cè),更新信息如下:
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]]>The post Becker&Hickl發(fā)布新品SPC-QC-104三通道TCSPC/FLIM模塊 appeared first on 深圳市檀臻科技有限公司.
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該模塊在Windows 10 和 Windows 11下的bh的SPCM數(shù)據(jù)采集和控制軟件上運(yùn)行。SPCM提供常用的操作模式,用于記錄光信號(hào)的時(shí)域波形,序列記錄,時(shí)間-或參數(shù)-標(biāo)簽記錄,F(xiàn)LIM,空間和時(shí)間馬賽克拼接FLIM,觸發(fā)的快速時(shí)間序列曲線和圖像的累積,以及同時(shí)的FLIM / PLIM。FLIM模式下的像素?cái)?shù)可以高達(dá)4096 x 4096,像素率可以在MHz級(jí)別,F(xiàn)LIM數(shù)據(jù)分析由bh的SPCImage NG軟件執(zhí)行。

來(lái)自通道1,2,3的FLIM圖像
SPC-QC-104非常適用于需要多通道測(cè)量,高計(jì)數(shù)率和光子相關(guān)測(cè)量的實(shí)驗(yàn)。
詳細(xì)參數(shù)鏈接:
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]]>原文鏈接 by Wolfgang Becker
翻譯 by 譚瓅
摘要:這篇文章試圖幫助bh FLIM技術(shù)的現(xiàn)有和未來(lái)用戶從FLIM實(shí)驗(yàn)中獲得最佳結(jié)果。第一部分解釋了TCSPC FLIM的原理,并給出了記錄的光子分布的效果。它表明,測(cè)量壽命的信噪比在優(yōu)先取決于記錄的光子數(shù)量。第二部分重點(diǎn)介紹優(yōu)化光子數(shù),而不增加施加到樣品中的光應(yīng)力。我們討論了激發(fā)功率、采集時(shí)間、采集效率、數(shù)值孔徑、聚焦精度、對(duì)準(zhǔn)精度和探測(cè)器效率的影響。第三部分將重點(diǎn)介紹光子效率。它考慮了TCSPC計(jì)時(shí)參數(shù)、計(jì)數(shù)背景、像素?cái)?shù)、儀器響應(yīng)函數(shù)的影響,以及多指數(shù)衰減函數(shù)的挑戰(zhàn)。最后一部分專門介紹數(shù)據(jù)分析。本文中的所有結(jié)論均通過(guò)在實(shí)際條件下記錄的真實(shí)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行演示。
數(shù)據(jù)分析無(wú)法彌補(bǔ)低質(zhì)量的FLIM數(shù)據(jù),但可以從樣本和實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)后采集的數(shù)據(jù)里提取大量信息,詳情參考文獻(xiàn)[3]。以下部分僅介紹幾個(gè)要點(diǎn),并在典型的 FLIM 數(shù)據(jù)上進(jìn)行了演示。
關(guān)于FLIM數(shù)據(jù)分析的第一個(gè)問(wèn)題通常是:我應(yīng)該使用哪種模型?需要多少個(gè)衰減分量才能擬合結(jié)果?
答案并不取決于樣品實(shí)際具有的衰減分量的數(shù)量,而是取決于你希望從樣品中找出什么信息。因此,除了你自己,沒(méi)有人能回答這個(gè)問(wèn)題。你對(duì)特定生物系統(tǒng)中正在發(fā)生的事情有一個(gè)假設(shè),你設(shè)計(jì)了一個(gè)實(shí)驗(yàn)和一個(gè)樣本來(lái)確認(rèn)或排除假設(shè)。只有你才能知道樣品中預(yù)期會(huì)發(fā)生什么,只有你才能知道衰減函數(shù)中預(yù)計(jì)會(huì)有多少分量。因此,你應(yīng)該選擇不同的,并具有相應(yīng)衰減分量數(shù)的模型(并且只有這個(gè)模型)來(lái)擬合數(shù)據(jù)。
比如,你正在做一個(gè)蛋白質(zhì)相互作用實(shí)驗(yàn),采用FRET作為蛋白質(zhì)相互作用的指示,用供體標(biāo)記一種蛋白質(zhì),用受體標(biāo)記另一種蛋白質(zhì)。在蛋白質(zhì)相互作用的地方應(yīng)該發(fā)生FRET,F(xiàn)RET縮短了供體的熒光壽命。因此,您可以在供體發(fā)射波長(zhǎng)處獲取FLIM數(shù)據(jù)。在 SPCImage 中加載數(shù)據(jù)并使用單指數(shù)模型運(yùn)行分析。細(xì)胞膜中的熒光壽命最短處 – 正是您預(yù)計(jì)的蛋白質(zhì)相互作用的地方(圖30,左)。
您可以檢查圖像的幾個(gè)特征點(diǎn)中的衰減函數(shù)。在壽命較短的地方,單指數(shù)模型不能正確擬合衰減函數(shù),但雙指數(shù)模型適合(圖 30,左二)。這是合理的:首先,并非所有供體分子都對(duì)受體具有正確的取向(FRET發(fā)生條件之一)。其次,蛋白質(zhì)相互作用是一種化學(xué)平衡,應(yīng)該有相互作用和非相互作用的供體的混合。這些組分具有不同的壽命,因此衰減曲線應(yīng)該是雙指數(shù)的。
現(xiàn)在,您可以使用雙指數(shù)模型運(yùn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)于顯示,請(qǐng)選擇振幅加權(quán)平均壽命 tm,這是經(jīng)典 FRET 效率的表示,如圖 30 右二所示。接下來(lái),選擇快衰減分量和慢衰減分量的振幅之比,該比值表示相互作用和非相互作用的供體的相對(duì)數(shù)量,它在細(xì)胞膜中蛋白質(zhì)相互作用的地方最高,見(jiàn)圖30,右圖。結(jié)果表明,雙指數(shù)模型適合擬合數(shù)據(jù),并且表明初始假設(shè)可能是正確的。

圖 30:FLIM-FRET 測(cè)量結(jié)果。從左到右:?jiǎn)沃笖?shù)壽命圖像,光標(biāo)位置衰減曲線,雙指數(shù)模型的振幅加權(quán)壽命圖像(顯示經(jīng)典FRET強(qiáng)度),振幅比圖像,顯示相互作用蛋白質(zhì)的相對(duì)比值)。
SPCImage提供了幾個(gè)選項(xiàng)來(lái)顯示衰減函數(shù)的參數(shù):經(jīng)典的單指數(shù)壽命,衰減分量的壽命,振幅加權(quán)平均值和強(qiáng)度加權(quán)平均的分量壽命值,以及衰減分量中包含的相對(duì)強(qiáng)度,參考文獻(xiàn)[3],SPCImage 還顯示這些參數(shù)的比值。如果可能,應(yīng)選擇最清楚地顯示感興趣效果的參數(shù)組合。例如,在 FRET測(cè)量中,雙指數(shù)擬合的振幅加權(quán)壽命表示經(jīng)典的 FRET效率,以及振幅之比 a1/a2(相互作用供體的相對(duì)比值)。示例如上圖 30 所示。
代謝成像的示例如圖31所示。左圖顯示了自由和束縛NADH的衰減分量的振幅比,該參數(shù)表征細(xì)胞的代謝狀態(tài)。分量壽命(t1 和 t2)的圖像顯示在中間和右側(cè),壽命的不均勻性表明NADH處在單個(gè)線粒體中的不同的分子環(huán)境。

圖31:從左到右:活細(xì)胞的NADH圖像。振幅比,a1/a2(未束縛/束縛比)以及快衰減分量(t1,未束縛的NADH)和慢衰減分量(t2,束縛的NADH)的圖像。FLIM數(shù)據(jù)格式 512×512像素。底部:選定點(diǎn)的衰減曲線,1024個(gè)時(shí)間通道,時(shí)間通道寬度 10ps。
FLIM用戶通常不贊成將壽命數(shù)據(jù)合并,認(rèn)為這是一種不科學(xué)地調(diào)整測(cè)量結(jié)果的方式。然而,正確的合并是任何準(zhǔn)確可靠的FLIM數(shù)據(jù)分析的關(guān)鍵。光學(xué)系統(tǒng)成像時(shí),空間分辨率受到衍射極限的限制,單點(diǎn)光的衍射圖稱為Airy圓盤或(在顯微鏡下)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)。為了達(dá)到衍射極限分辨率,數(shù)據(jù)不得通過(guò)像素化來(lái)模糊。根據(jù)經(jīng)驗(yàn),點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的中心圓盤應(yīng)約按 5 x 5像素采樣,當(dāng)然,此區(qū)域內(nèi)像素中的壽命信息非常相似。因此,將這些像素的時(shí)間數(shù)據(jù)組合用于FLIM分析是合適的,請(qǐng)參見(jiàn)圖32左。結(jié)果是光子數(shù)大幅增加,壽命精度相應(yīng)提高。請(qǐng)注意,合并5 x 5像素區(qū)域會(huì)使凈光子數(shù)增加25倍!
在 SPCImage 軟件中,通過(guò)組合定義合并區(qū)域的數(shù)據(jù)并將凈衰減曲線分配給中心像素來(lái)執(zhí)行合并。因此,圖像中的有效像素?cái)?shù)不會(huì)改變,該程序還符合優(yōu)質(zhì)圖像的美學(xué)角度。從視覺(jué)上看,圖像在開(kāi)始看起來(lái)很丑陋之前,包含大量的強(qiáng)度噪聲。然而,在FLIM應(yīng)用中,壽命數(shù)據(jù)中相同數(shù)量的噪聲將使數(shù)據(jù)無(wú)用。因此,在具有一定強(qiáng)度噪聲的大量像素下顯示圖像是有意義的,但壽命平均在更大的區(qū)域內(nèi),并且相應(yīng)地增加了信噪比。
SPCImage 中的像素合并原理如圖 32 右所示。

圖 32:左:對(duì)強(qiáng)度圖像中的 Airy 圓盤進(jìn)行過(guò)采樣,以及合并像素用于壽命計(jì)算。右:用于壽命計(jì)算的像素重疊合并。
SPCImage 軟件中合并參數(shù)(binning parameter) n 的含義如圖 33 所示。請(qǐng)注意,合并系數(shù)2對(duì)應(yīng) 5 x 5 像素區(qū)域,即大致對(duì)應(yīng)于正確采樣圖像中點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的面積。無(wú)意中,圖像通常使用較高的過(guò)采樣率拍攝,尤其是在使用掃描儀的高變焦系數(shù)時(shí)。因此,SPCImage提供合并系數(shù)最多為10像素合并,對(duì)應(yīng) 20 x 20 的像素區(qū)域。

圖 33:合并系數(shù)n的功能,‘Square’(左)和‘Circular’ (右)合并。
圖 34 給出了像素合并(binning)效果的演示,用512 x 512像素掃描BPEA樣品,將衰減曲線記錄到1024個(gè)時(shí)間通道中。未做像素合并的數(shù)據(jù)如圖 34 的頂行所示。左側(cè)顯示了(單指數(shù))壽命圖像。在不進(jìn)行像素合并的情況下,每個(gè)像素的光子數(shù)量極低,請(qǐng)參閱中圖。因此,壽命圖像看起來(lái)很嘈雜,衰減時(shí)間散布在各處,請(qǐng)參閱右側(cè)的壽命直方圖。圖 34 的底行顯示了使用像素合并的數(shù)據(jù)。采用圓形合并,合并系數(shù)為 2,對(duì)應(yīng)21 個(gè)像素區(qū)域的合并。壽命圖像質(zhì)量?jī)?yōu)異,凈衰減函數(shù)具有足夠的光子以進(jìn)行合理擬合,并且壽命直方圖具有合理的寬度。從圖像中可以看出,顏色不會(huì)模糊,即像素合并不會(huì)對(duì)整個(gè)壽命的空間分辨率造成明顯的損失。

圖 34:像素合并(binning)在壽命分析中的影響。512 x 512 像素,1024 個(gè)時(shí)間通道。頂部:無(wú)合并。底部:合并系數(shù) 2,圓形合并,21個(gè)像素的衰減曲線的總和用于中心像素的分析。
合并系數(shù)為2(將21個(gè)像素的衰減曲線合并到中心像素中,見(jiàn)圖33),合并后的數(shù)據(jù)甚至足以進(jìn)行雙指數(shù)衰減分析。結(jié)果如圖 35 所示,頂行從左到右顯示了快衰減分量和慢衰減分量的壽命圖像,以及兩個(gè)分量振幅之比的圖像。這三幅圖像在空間分辨率和壽命分辨率方面都具有良好的質(zhì)量。底行顯示參數(shù)直方圖,它們表明,分量壽命和振幅比是在良好的信噪比下獲得的(請(qǐng)注意不同的參數(shù)范圍)。

圖 35:與圖 34 中底行數(shù)據(jù)相同,雙指數(shù)衰減分析。從左到右:快分量的壽命圖像t1,慢分量的壽命圖像t2,振幅比圖像a1/a2。請(qǐng)注意不同的參數(shù)范圍。
圖36顯示了合并對(duì)壽命信息的空間分辨率的影響。該圖顯示了圖34和圖35中大細(xì)胞中心70 x 70像素區(qū)域的數(shù)據(jù)。正如預(yù)期的那樣,在合并系數(shù)≤2時(shí),壽命對(duì)比度基本保持不變,請(qǐng)參考中心的花狀結(jié)構(gòu)。對(duì)于 4 和 6(右2和右1)的合并系數(shù),壽命對(duì)比度開(kāi)始降低。來(lái)自相鄰像素的太多衰減數(shù)據(jù)被混合到凈衰減函數(shù)中,因此,中間的結(jié)構(gòu)越來(lái)越多地采用其更周圍緊鄰環(huán)境的壽命值。

圖36:放大圖34數(shù)據(jù)的70 x 70像素區(qū)域,顯示大細(xì)胞的中心。不同的合并系數(shù),從左到右的n= 0、1、2、4 和 6。在 bin ≤2(中心圖像),使用壽命對(duì)比度保持不變。它在 bin = 4 和bin = 6 時(shí)壽命對(duì)比度會(huì)降低,這可以從中心結(jié)構(gòu)顏色的褪色中看出。
與合并空間相關(guān)像素合并(binning)相比,圖像分割是組合了具有類似衰減特征的像素。
該過(guò)程如圖37左上所示,圖37顯示了SPCImage面板,其中包含低光子數(shù)的FLIM數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)與圖 34 上行中的數(shù)據(jù)相同,所選像素中的衰減數(shù)據(jù)顯示在面板的右下角。根據(jù)這些數(shù)據(jù)計(jì)算出的壽命圖像是嘈雜的,并且壽命的直方圖(右上)非常寬。下一步如圖 37(右上方)所示。相量圖(phasor plot)是根據(jù)數(shù)據(jù)計(jì)算得出的,不出所料,相量分散在各處。
然而,壽命明顯不同的像素的相量(由顏色表示)出現(xiàn)在不同的相位/振幅位置。
在第三步中,選種一系列相量值,并在壽命圖像中突出顯示相應(yīng)的像素,請(qǐng)參見(jiàn)圖 37 左下角。可以移動(dòng)選擇區(qū)域,更改其大小和形狀以突出顯示圖像中的所需結(jié)構(gòu)。在所示的示例中,已選擇細(xì)胞的線粒體。即使選擇可能不完整,所選像素也都在圖像的所需結(jié)構(gòu)內(nèi)。
在最后一步,圖37,右下角,所選像素的衰減數(shù)據(jù)被組合成一條衰減曲線,這條曲線包含超過(guò)300萬(wàn)個(gè)光子。相比之下,圖34中單個(gè)像素中只有幾百個(gè)光子,在n=2的合并區(qū)域中大約有3000個(gè)光子。具有300萬(wàn)光子的衰減曲線可以進(jìn)行高精度分析,三指數(shù)分析很輕松,如圖 37 右下角所示,三指數(shù)衰減參數(shù)顯示在面板的右上方。

圖37:通過(guò)相量圖進(jìn)行圖像分割,并將所選像素組合成高光子數(shù)的單衰減曲線。
如果減少衰減參數(shù)的數(shù)量,多指數(shù)衰減分析將變得更加容易。因此,在數(shù)據(jù)分析中包括先驗(yàn)知識(shí)可以減少結(jié)果中的噪聲。圖38顯示了小鼠開(kāi)放性腫瘤的NADH圖像,用bh DCS-120 MACRO系統(tǒng)成像,有趣的參數(shù)是快速衰減分量的振幅a1。它代表游離NADH的比例,并指示組織相應(yīng)區(qū)域的新陳代謝類型。因此,使用雙指數(shù)模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,并創(chuàng)建了a1圖像。使用所有參數(shù)(t1,t2,a1,a2)自由浮動(dòng)來(lái)分析左側(cè)的圖像,固定t2分析右側(cè)的圖像。不出所料,右側(cè)的圖像噪點(diǎn)較小,腫瘤在圖像和a1直方圖中都更清晰地突出。右側(cè)的直方圖甚至顯示兩個(gè)不同的像素群,一個(gè)為 a1 = 0.65,另一個(gè)為 a1 = 0.83,這些正是通常在健康組織和腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)的振幅。

圖38:小鼠腫瘤的NADH圖像顯示快速NADH成分的振幅a1。左:T1、t2、a1、a2浮動(dòng)。右:t2 固定為最常用值,2400 ps。下行:圖像像素上 a1 的直方圖。
在衰減分量的壽命預(yù)計(jì)恒定的情況下,使用固定參數(shù)進(jìn)行分析可以大大降低噪聲。但是,必須謹(jǐn)慎使用該技術(shù),熒光壽命從來(lái)都不是絕對(duì)恒定的,分子環(huán)境總是有影響的。如果分量壽命是固定的,但不是絕對(duì)恒定的,則擬合過(guò)程會(huì)以其他參數(shù)的較大變化來(lái)響應(yīng)。因此,在固定分量壽命條件下,獲得的擬合結(jié)果可能具有較大的系統(tǒng)誤差。
FLIM圖像應(yīng)清晰明了地展示相關(guān)論文中聲稱的科學(xué)事實(shí),圖像不僅應(yīng)顯示正確的衰減參數(shù),還應(yīng)將其顯示在適當(dāng)?shù)膹?qiáng)度和衰減參數(shù)范圍內(nèi)。默認(rèn)情況下,SPCImage 使用強(qiáng)度自動(dòng)縮放,在正常情況下,自動(dòng)縮放會(huì)產(chǎn)生合理的圖像。但是,自動(dòng)縮放功能無(wú)法知道圖像的哪個(gè)部分是包含感興趣信息的部分。如果信息位于圖像的暗淡區(qū)域,則自動(dòng)縮放不一定能提供最佳圖像。此外,其他完美的圖像也可能包含一些過(guò)于明亮的點(diǎn)。在這些情況下,無(wú)論它們來(lái)自何處,自動(dòng)縮放都不會(huì)生成合理縮放的圖像,因此,應(yīng)關(guān)閉自動(dòng)縮放,并手動(dòng)調(diào)整強(qiáng)度刻度。圖39 顯示了一個(gè)示例,自動(dòng)縮放(左)會(huì)導(dǎo)致不良的縮放強(qiáng)度范圍,手動(dòng)調(diào)整強(qiáng)度范圍可生成正確平衡的圖像(右圖)。
具有不同參數(shù)比例的圖像的顯示如圖40和圖41所示,這些圖像顯示了分別以藍(lán)-綠-紅和紅-綠-藍(lán)兩色方向顯示的壽命圖像。參數(shù)范圍為 2000 到 3000 ps(左)和 2300 到 2700 ps(右)。哪種風(fēng)格最能體現(xiàn)感興趣的效果,必須根據(jù)具體情況來(lái)決定。

圖39:包含一些非常亮點(diǎn)的圖像。左:強(qiáng)度范圍的自動(dòng)縮放,自動(dòng)縮放功能可將強(qiáng)度縮放到最亮的特征,獲得的強(qiáng)度范圍不適合圖像的其余部分。右:手動(dòng)縮放可在正確的強(qiáng)度范圍內(nèi)生成圖像,單指數(shù)擬合的壽命,顏色范圍從2000 ps(藍(lán)色)到 3000 ps(紅色)。

圖40:圖39所示數(shù)據(jù)的不同表示形式,單指數(shù)壽命,手動(dòng)強(qiáng)度縮放。左:顏色方向 b-g-r,顏色范圍為 2000 至 3000 ps。右:顏色方向 b-g-r,顏色范圍為 2300 至 2700 ps。

圖 41:圖 39 中所示數(shù)據(jù)的不同表示形式,單指數(shù)壽命,手動(dòng)強(qiáng)度縮放。左:顏色方向 r-g-b,顏色范圍為 2000 至 3000 ps。右:顏色方向 r-g-b,顏色范圍為 2300 至 2700 ps。
熒光壽命可以從TCSPC FLIM數(shù)據(jù)中得出,信噪比接近每像素光子數(shù)的平方根。因此,表征FLIM數(shù)據(jù)質(zhì)量的最重要參數(shù)是光子數(shù)。通過(guò)使用實(shí)際示例,我們已經(jīng)證明,通過(guò)簡(jiǎn)單地優(yōu)化探測(cè)效率和采集時(shí)間,可以獲得光子數(shù)為10倍。通過(guò)使用高效率的探測(cè)器,可以增加4倍,優(yōu)化的像素合并策略可以增加25倍。總而言之,這是光子數(shù)為1000倍、信噪比為32倍的提升。我們并不是說(shuō)在所有情況下都可以達(dá)到如此大的改進(jìn),但幾乎在任何時(shí)候都可以實(shí)現(xiàn)相當(dāng)大的改進(jìn)。
FLIM系統(tǒng)的第二個(gè)重要參數(shù)是光子效率,光子效率描述了系統(tǒng)探測(cè)到的單個(gè)光子對(duì)結(jié)果的貢獻(xiàn)程度。換句話說(shuō),它描述了系統(tǒng)與理想信噪比SQRT(N)的接近程度。雖然TCSPC系統(tǒng)接近理想,但光子效率通常可以通過(guò)使用正確的TCSPC定時(shí)參數(shù),避免記錄背景信號(hào)以及使用足夠快IRF的探測(cè)器來(lái)優(yōu)化。通常,光子效率提高兩到四倍是可能的,只需遵守一些簡(jiǎn)單的信號(hào)記錄規(guī)則即可。
當(dāng)記錄和分析多指數(shù)衰減函數(shù)時(shí),數(shù)據(jù)質(zhì)量變得尤為重要。在最常見(jiàn)的FLIM應(yīng)用中,多指數(shù)衰減是必須的。然后,信息主要在于衰減分量的振幅和壽命,而不是凈衰減函數(shù)的表觀壽命。這意味著不僅探測(cè)效率和光子效率很重要,儀器響應(yīng)函數(shù)IRF的寬度也很重要。此外,解析多指數(shù)衰減函數(shù)的選項(xiàng)在很大程度上取決于衰減函數(shù)的形狀,它們偏離單指數(shù)曲線的距離越大,就越能很好地分辨它們。因此,考慮好FLIM選項(xiàng)的實(shí)驗(yàn)規(guī)劃和樣品優(yōu)化設(shè)計(jì)可以對(duì)研究的結(jié)果產(chǎn)生巨大影響。
最后,數(shù)據(jù)分析在任何FLIM實(shí)驗(yàn)中都起著重要作用,正確應(yīng)用的數(shù)據(jù)分析可以從記錄的數(shù)據(jù)中提取最大數(shù)量的信息。此外,它能夠以出版就緒的風(fēng)格呈現(xiàn)數(shù)據(jù),令人信服地支持相關(guān)出版物中提出的科學(xué)主張。
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翻譯 by 譚瓅
摘要:這篇文章試圖幫助bh FLIM技術(shù)的現(xiàn)有和未來(lái)用戶從FLIM實(shí)驗(yàn)中獲得最佳結(jié)果。第一部分解釋了TCSPC FLIM的原理,并給出了記錄的光子分布的效果。它表明,測(cè)量壽命的信噪比在優(yōu)先取決于記錄的光子數(shù)量。第二部分重點(diǎn)介紹優(yōu)化光子數(shù),而不增加施加到樣品中的光應(yīng)力。我們討論了激發(fā)功率、采集時(shí)間、采集效率、數(shù)值孔徑、聚焦精度、對(duì)準(zhǔn)精度和探測(cè)器效率的影響。第三部分將重點(diǎn)介紹光子效率。它考慮了TCSPC計(jì)時(shí)參數(shù)、計(jì)數(shù)背景、像素?cái)?shù)、儀器響應(yīng)函數(shù)的影響,以及多指數(shù)衰減函數(shù)的挑戰(zhàn)。最后一部分專門介紹數(shù)據(jù)分析。本文中的所有結(jié)論均通過(guò)在實(shí)際條件下記錄的真實(shí)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行演示。
如“信噪比”小節(jié)中所述,TCSPC系統(tǒng)能夠達(dá)到SNR = SQRT(N)的理論信噪比。然而,這要求探測(cè)到的每個(gè)熒光光子都會(huì)向結(jié)果貢獻(xiàn)其最大的信息量。這要求正確配置TCSPC計(jì)時(shí)(timing)參數(shù),避免記錄背景光子,并以足夠高的精度確定光子時(shí)間,這一部分將討論這些要點(diǎn)。
觀測(cè)時(shí)間間隔可以對(duì)壽命的信噪比產(chǎn)生影響。圖 16 顯示了一個(gè)示例,采集相同樣品的兩張圖像,采用相同的計(jì)數(shù)速率和相同的采集時(shí)間,激光重復(fù)率為50 MHz。在5 ns的觀測(cè)時(shí)間間隔內(nèi)記錄了左側(cè)圖像,壽命約為2.2 ns,熒光在觀測(cè)時(shí)間間隔內(nèi)不會(huì)完全衰減,見(jiàn)圖16,第二行左。結(jié)果,衰減函數(shù)尾部的光子沒(méi)有被記錄下來(lái),數(shù)據(jù)分析過(guò)程只能從記錄的部分衰減確定壽命。因此,像素上壽命的分布比理想條件下更寬,參見(jiàn)圖16,左下角。圖 16 中所示的情況非常常見(jiàn),較短的觀測(cè)時(shí)間間隔非常適用于壽命極短的樣品,然而,它們也可能無(wú)意中被用于較長(zhǎng)的使用壽命,從而獲得欠佳的光子效率。
右側(cè)的圖像是在12 ns的觀測(cè)時(shí)間間隔內(nèi)記錄的,幾乎所有的光子的衰減函數(shù)都被記錄下來(lái),數(shù)據(jù)分析可用整個(gè)衰減函數(shù)來(lái)確定壽命,見(jiàn)圖16的第二行右。因此,壽命的分布(圖16,右下角)比左圖窄。

圖16:在5 ns(左)和12 ns(右)的觀測(cè)時(shí)間間隔內(nèi)記錄的圖像。衰減曲線和直方圖顯示在第二行和第三行。
此外,衰減曲線在觀測(cè)時(shí)間間隔中的位置也會(huì)對(duì)光子效率產(chǎn)生影響。圖 17 顯示了一個(gè)示例。對(duì)于左側(cè)圖像,衰減曲線未正確放置在觀測(cè)時(shí)間窗口中,曲線向右移動(dòng),因此衰減曲線的遠(yuǎn)端不會(huì)被記錄。圖 17(左)中參數(shù)設(shè)置中的錯(cuò)誤可能看起來(lái)微不足道且易于糾正 (參考文獻(xiàn)[2]),但在TCSPC FLIM數(shù)據(jù)中經(jīng)常遇到這種情況。
在右側(cè)的圖像中,衰減數(shù)據(jù)被完美地放置在觀測(cè)時(shí)間窗口中,并記錄了整個(gè)衰減曲線。不僅沒(méi)有光子的損失,擬合時(shí)還具有更大的時(shí)間間隔,它可以很好地用于確定壽命值。因此,正確居中的衰減數(shù)據(jù)的壽命直方圖明顯變窄,見(jiàn)圖17,底部。標(biāo)準(zhǔn)差 στ 為 80 ps,而左側(cè)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差為 118 ps。這是一個(gè)1.48的比率,正確居中的衰減數(shù)據(jù)更佳。στ 中 1.48 的比率可能聽(tīng)起來(lái)不多,然而,它轉(zhuǎn)化為光子效率是2.18倍。這意味著錯(cuò)誤配置的系統(tǒng)需要2.18倍的光子數(shù)(或2.18倍的采集時(shí)間!),才能達(dá)到與右側(cè)系統(tǒng)相同的壽命精度。

圖17:衰減曲記錄欠佳的影響。在左圖中,衰減曲線被不正確地放置在觀測(cè)時(shí)間窗口中,衰減曲線的遠(yuǎn)端沒(méi)有記錄。在右圖中,衰減數(shù)據(jù)完美地放置在觀測(cè)時(shí)間窗口中。記錄整個(gè)衰減曲線。正確居中的衰減數(shù)據(jù)的壽命直方圖明顯更窄。
圖 16 和圖 17 中左右的壽命圖像的比較也顯示了另一個(gè)效果:
左側(cè)圖像中的壽命偏向于較小的值,原因是熒光衰減不是純粹的單指數(shù)。慢衰減分量在衰減曲線的尾部最為突出,而它在丟失的部分?jǐn)?shù)據(jù)中。當(dāng)數(shù)據(jù)分析過(guò)程使用單指數(shù)模型擬合數(shù)據(jù)時(shí),它只能優(yōu)化衰減數(shù)據(jù)記錄部分的擬合。在這一部分中,慢速分量的表示不足,結(jié)果是確定的壽命比實(shí)際時(shí)間短。采用一階矩技術(shù)的情況更糟,由于缺少熒光衰減的尾部,計(jì)算的矩太小,因此從一階矩得出的熒光壽命太小。
使用ps二極管激光器的FLIM系統(tǒng)可以在不同的激光重頻下工作,參考文獻(xiàn)[5,6,7]。標(biāo)準(zhǔn)重頻為 20 MHz、50 MHz 和 80 MHz,其他重頻也可按需定制。使用Ti:Sa激光器的多光子FLIM系統(tǒng)以80 MHz的頻率運(yùn)行,而采用飛秒光纖激光器的系統(tǒng)通常使用40 MHz,參考文獻(xiàn) [14]。哪種重頻最好?5 ns的熒光壽命是否仍能以 80 MHz 的重頻準(zhǔn)確測(cè)定?我是否應(yīng)該總是使用80 MHz,因?yàn)樗谐渥愕募ぐl(fā)功率?
圖18顯示了染料溶液掃描中選定點(diǎn)的衰減曲線,熒光壽命為5.6 ns。上部曲線以50 MHz獲得,下部曲線以80 MHz重頻獲得,光子數(shù)約為20,000,在兩條曲線中大致相同,但這兩條曲線都包含大量來(lái)自上一個(gè)激發(fā)脈沖激發(fā)出的光子的“不完全衰減”。當(dāng)然,在80 MHz的記錄中,不完全衰減的量更高,因?yàn)闊晒馑p的時(shí)間更短。顯而易見(jiàn),衰減不完全的數(shù)據(jù)不能用一階矩技術(shù)來(lái)分析。它們可以使用SPCImage的“不完全衰減”模型進(jìn)行處理,以這種方式處理圖像會(huì)產(chǎn)生圖18中右圖所示的壽命分布。

圖18:染料溶液的熒光衰減函數(shù),5.6 ns熒光壽命。頂部:激光重復(fù)率 50 MHz。底部:激光重復(fù)率 80 MHz。左側(cè):衰減曲線。右側(cè):像素上壽命的直方圖。
結(jié)果是令人意外的:盡管50-MHz曲線看起來(lái)更加“分析友好”,但直方圖實(shí)際上是相同的。為什么?原因是5.6 ns衰減和另一個(gè)5.6 ns衰減的總和偏移了一個(gè)周期,仍然是5.6 ns衰減。因此,擬合程序以合理的標(biāo)準(zhǔn)偏差提供正確的壽命值。標(biāo)準(zhǔn)偏差大于20,000光子的理想值,但對(duì)于兩個(gè)記錄都是相同的。與理想記錄相比的損失來(lái)自記錄時(shí)間間隔不覆蓋整個(gè)衰減的事實(shí),而不是來(lái)自存在不完全衰減的事實(shí)。圖 19 支持這一點(diǎn),它顯示50 MHz的記錄,但在20 ns的觀測(cè)時(shí)間間隔內(nèi),壽命分布明顯更窄。

圖19:5.6 ns的熒光衰減,以50 MHz的重頻,記錄在20 ns的觀測(cè)時(shí)間間隔內(nèi)。
所以結(jié)論是:如果可能的話,使用盡可能覆蓋熒光衰減的記錄時(shí)間窗口。如果因?yàn)榧す饷}沖周期太短而無(wú)法這樣做,不要擔(dān)心,數(shù)據(jù)分析將處理不完整的衰減,并提取最佳的壽命信息。
計(jì)數(shù)背景不僅是FLIM數(shù)據(jù)中最常見(jiàn)的缺陷,也是最具破壞性的缺陷。幸運(yùn)的是,這也是最容易避免的,在大多數(shù)情況下,背景只是來(lái)自日光的影響。最脆弱的是采用非解掃探測(cè)(NDD)的多光子系統(tǒng),這些系統(tǒng)沒(méi)有針孔可以阻擋來(lái)自激發(fā)點(diǎn)外部的光,它們直接探測(cè)樣品散射出來(lái)的光子,從樣品表面的大面積區(qū)域收集光,這樣做的副作用是它們對(duì)環(huán)境光也很敏感。因此,必須使系統(tǒng)遠(yuǎn)離日光。
圖20顯示了如果衰減數(shù)據(jù)被背景計(jì)數(shù)覆蓋會(huì)發(fā)生什么情況。熒光光子(a)的平均到達(dá)時(shí)間<t> = τ,時(shí)序噪聲為σt = τ。我們可以單獨(dú)建立熒光光子的光子分布,它將代表真正的熒光衰減曲線(a,右),以στ = τ / SQRT(N)的標(biāo)準(zhǔn)偏差提供熒光壽命,即光子效率為1。背景光子(b)在整個(gè)觀測(cè)時(shí)間窗口(T)上均勻分布,它們的平均到達(dá)時(shí)間為T/2,時(shí)序噪聲為σtbkg=0.28 T(見(jiàn)圖24)。
記錄過(guò)程在熒光和背景光子之間沒(méi)有區(qū)別,因此,探測(cè)到的信號(hào)(c)是熒光衰減和背景的總和。這會(huì)導(dǎo)致兩個(gè)不利影響:首先,平均到達(dá)時(shí)間不再是熒光衰減時(shí)間τ,相反,它是壽命τ和背景光子平均T/2的光子數(shù)加權(quán)平均值,因此,數(shù)據(jù)不能通過(guò)一階矩或基于矩的任何其他技術(shù)進(jìn)行分析。
其次,有效定時(shí)噪聲是熒光光子的定時(shí)噪聲σt = τ和背景的定時(shí)噪聲σtbkd = 0.28 T的加權(quán)和。在大多數(shù)情況下,0.28 T 大于 τ,因此,它對(duì)凈標(biāo)準(zhǔn)差(測(cè)量壽命的 στmeas)有很大的影響。精確計(jì)算στmeas以及光子效率是困難的,并且提供的結(jié)果不容易解釋。上述討論表明,計(jì)數(shù)背景對(duì)探測(cè)到的熒光壽命有很大影響。

圖20:計(jì)數(shù)背景對(duì)光子時(shí)間的影響
一個(gè)實(shí)際示例如圖 21 所示,來(lái)自同一樣品的FLIM圖像以帶背景(左)和不帶背景(右)記錄。在左圖中,每個(gè)像素中的背景約為900計(jì)數(shù)(所有時(shí)間通道的總和),在右圖中接近于零,最亮像素中的熒光光子數(shù)量約為4000。因此,背景明顯損害了圖像的對(duì)比度,參見(jiàn)圖21,左圖。然而,對(duì)比度的損失并不是那么糟糕,但圖像模糊了。右圖沒(méi)有背景,因此提供了最大的對(duì)比度。
所選點(diǎn)中的衰減曲線顯示在第二行中,左圖的衰減曲線包含背景計(jì)數(shù),右圖的衰減曲線不包含背景計(jì)數(shù)。背景似乎很溫和,看起來(lái)不像是一個(gè)真正的問(wèn)題,然而,對(duì)壽命準(zhǔn)確性的影響是巨大的。這可以在圖21的第三行中看到,它顯示了每個(gè)記錄的phasor?plot圖和按一階矩計(jì)算的壽命直方圖。可以很容易地看出,左側(cè)數(shù)據(jù)組的直方圖和phasor?plot圖不僅完全偏移,而且極度展寬。原因不僅在于背景為光子數(shù)據(jù)增加了時(shí)序噪聲,還在于背景為矩增加了偏移。由于熒光信號(hào)和背景信號(hào)的比值隨像素的亮度而變化,因此壽命值被極度模糊。
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圖21:計(jì)數(shù)背景對(duì)FLIM精度的影響。左:帶背景計(jì)數(shù)的 FLIM 數(shù)據(jù)。右:無(wú)背景記錄。上行:圖像。第二行:所選點(diǎn)中的衰減數(shù)據(jù)。第三行:M1 分析的Phasor plots圖和壽命直方圖。最下行:采用 MLE 分析的壽命直方圖。
圖21的底行顯示了采用MLE分析獲得的壽命直方圖,就壽命移位而言,擬合過(guò)程比矩分析做得更好。壽命大約是170 ps,直方圖比右邊的無(wú)背景記錄寬兩倍,壽命標(biāo)準(zhǔn)偏差的兩倍轉(zhuǎn)化為光子效率是相差四倍!
與普遍的觀點(diǎn)相反,衰減曲線中的時(shí)間通道數(shù)對(duì)信噪比沒(méi)有直接影響。它沒(méi)有出現(xiàn)在一階矩分析推導(dǎo)的SNR方程(“信噪比”小節(jié))中,并且擬合例程進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并不關(guān)心FLIM數(shù)據(jù)在兩倍的時(shí)間通道中是否只有一半的光子數(shù)量,反之亦然。只有衰減曲線中的光子總數(shù)才重要,圖22給出了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。它顯示了一個(gè)用Alexa 488染色的樣品,在所使用的探測(cè)波長(zhǎng)下,整個(gè)掃描區(qū)域的壽命幾乎是均勻的。第一行中的數(shù)據(jù)用64個(gè)時(shí)間通道記錄,第二行的數(shù)據(jù)用1024個(gè)時(shí)間通道記錄,圖像中的光子總數(shù)幾乎相同。正如預(yù)期的那樣,壽命直方圖(第一行和第二行,右)幾乎相同。

圖22:使用不同數(shù)量的時(shí)間通道,相同的光子總數(shù)進(jìn)行記錄。上排:64 個(gè)時(shí)間通道。下排:1024個(gè)時(shí)間通道。從左到右:圖像,光標(biāo)位置的衰減曲線,單指數(shù)擬合,像素上壽命直方圖。與普遍的觀點(diǎn)相反,在64通道記錄中,每個(gè)時(shí)間通道的光子數(shù)量越多,并沒(méi)表現(xiàn)出更高的壽命精度。
壽命的SNR與時(shí)間通道數(shù)無(wú)關(guān),這并不意味著可以使用數(shù)量任意小的時(shí)間通道和任意大的時(shí)間通道寬度。在兩個(gè)或四個(gè)時(shí)間通道中進(jìn)行探測(cè)會(huì)大大降低光子效率,參考文獻(xiàn)[1,10,16]。當(dāng)時(shí)間通道寬度與IRF寬度的數(shù)量級(jí)相同時(shí),SNR已經(jīng)開(kāi)始下降。這種情況下,不清楚IRF在第一個(gè)通道中的位置,以及熒光脈沖的上升開(kāi)始的位置。這增加了壽命計(jì)算的不確定性。根據(jù)經(jīng)驗(yàn),IRF和最快的衰減分量都應(yīng)使用不少于5至10個(gè)時(shí)間通道進(jìn)行采樣。這意味著,對(duì)于HPM-100-40探測(cè)器(IRF寬度120 ps),探測(cè)低至100 ps的快速衰減分量,時(shí)間通道寬度應(yīng)約為10 ps。對(duì)于 10 ns 的觀測(cè)時(shí)間間隔,時(shí)間通道數(shù)應(yīng)為 1024。對(duì)于 HPM-100-06(IRF 寬度<20 ps),將時(shí)間通道數(shù)增加到 4096(即將時(shí)間通道寬度減小到3 ps)是合理的,如果要探測(cè)超快衰減分量,采用更窄的時(shí)間通道更佳。
如果 FLIM 系統(tǒng)的 IRF 具有非零寬度,會(huì)發(fā)生什么情況?IRF的影響可以通過(guò)觀察光子到達(dá)時(shí)間來(lái)估計(jì)。讓我們假設(shè)我們已經(jīng)記錄或以其他方式確定了FLIM系統(tǒng)的IRF,然后,我們可以通過(guò)平均IRF測(cè)量的光子時(shí)間來(lái)定義IRF的“質(zhì)心<tirf>。如圖6所示,熒光衰減時(shí)間τ是通過(guò)簡(jiǎn)單地從平均光子時(shí)間<t>中減去<tirf>而獲得的,參見(jiàn)圖23,左圖。

圖 23:IRF 寬度不為零的系統(tǒng)中壽命測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差。左圖:壽命是光子的平均到達(dá)時(shí)間 t 減去 IRF 質(zhì)心的時(shí)間,<tirf>。右圖:測(cè)量壽命的標(biāo)準(zhǔn)差 τmeas 包含 IRF σirf 的貢獻(xiàn)。
以這種方式獲得的壽命標(biāo)準(zhǔn)偏差是多少?可以假設(shè)標(biāo)準(zhǔn)差仍然是τ / SQRT(N):IRF的質(zhì)心是準(zhǔn)確的,減去它不會(huì)改變t的標(biāo)準(zhǔn)差,但這是不可能的,因?yàn)楣庾訒r(shí)間本身包含來(lái)自IRF的不確定性,每個(gè)熒光光子定時(shí)參考在IRF中都是不同時(shí)間。另外,它可能在激光脈沖的不同時(shí)間被激發(fā),或者它花了不同的時(shí)間通過(guò)探測(cè)器,這增加了光子時(shí)間t的不確定性,并增加了IRF σirf對(duì)理想光子時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)偏差σt = τ的貢獻(xiàn)。
因此,測(cè)量光子乘以σtmeas的標(biāo)準(zhǔn)差大于τ,測(cè)量壽命的標(biāo)準(zhǔn)偏差στmeas大于τ / SQRT(N),可以通過(guò)下式來(lái)進(jìn)行估算:
στmeas = SQRT (τ2 + σ2irf) / SQRT (N)
或

σirf也被稱為“計(jì)時(shí)抖動(dòng)的RMS值”或 (有點(diǎn)誤導(dǎo)地)“IRF寬度的RMS值”。對(duì)于在實(shí)踐中遇到的IRF形狀,它大約是IRF半高寬(FWHM)最大值的0.43到0.87。圖 24 給出了幾種典型 IRF 形狀的 RMS 與 FWHM 值。對(duì)于高斯IRF,計(jì)時(shí)抖動(dòng)的RMS值為0.43 FWHM。對(duì)于非對(duì)稱函數(shù),這個(gè)值會(huì)更大。具有慢尾或帶有凸起的IRF會(huì)給衰減數(shù)據(jù)增加更多的時(shí)序噪聲,如果可能的話,應(yīng)該避免使用。請(qǐng)注意,尾部和凸起也可能源于過(guò)高功率下工作的皮秒二極管激光器。不利的IRF形狀造成的精度損失實(shí)際上可能超過(guò)光子數(shù)量增加帶來(lái)的增益。

圖 24:一些典型 IRF 形狀的 RMS 值。從左到右:矩形、高斯、x?e-x、有凸起的x?e-x、指數(shù)函數(shù) e-x 。函數(shù)歸一化為相同的FWHM,RMS值以FWHM的倍數(shù)給出。
從這個(gè)結(jié)果中可以得出兩個(gè)結(jié)論。第一個(gè)是,毫不奇怪,SNR仍然與N的平方根一起縮放。第二個(gè)是,只有當(dāng)IRF寬度的RMS大于熒光壽命的約50%至100%時(shí),SNR才會(huì)大幅下降。隨著IRF寬度的增加,壽命精度的下降緩慢。這導(dǎo)致了一種誤解,即FLIM系統(tǒng)的IRF寬度并不重要:典型熒光團(tuán)的熒光壽命在幾納秒的范圍內(nèi),因此,如果 IRF 是完全已知的,則 500 ps 到 1 ns(RMS) 的 IRF 寬度應(yīng)該就足夠了。然而,這與任何實(shí)際經(jīng)驗(yàn)相矛盾,錯(cuò)誤出在哪里?
FLIM中的熒光衰減函數(shù)不是單指數(shù)的,不僅如此,所需的信息通常是在衰減函數(shù)的組成中,而不是在凈“壽命”中。在這種情況下,IRF必須比最快的衰減分量快。FRET測(cè)量和自發(fā)熒光測(cè)量中的主要衰減成分分別低至約300 ps和100 ps,參考文獻(xiàn)[2],HPM-100-40 探測(cè)器非常適合這些應(yīng)用。在蘑菇孢子,參考文獻(xiàn)[12],人類頭發(fā)和哺乳動(dòng)物皮膚病變中,會(huì)遇到低至10 ps范圍的壽命。這些測(cè)量需要更快的探測(cè)器。示例將顯示在“多指數(shù)衰減函數(shù)”一節(jié)中。
當(dāng)FLIM僅用作激光掃描顯微鏡中的比對(duì)技術(shù)時(shí),熒光衰減的單指數(shù)近似值及其表觀壽命的測(cè)量可能就足夠了。然而,FLIM的真正應(yīng)用是分子成像。熒光團(tuán) – 無(wú)論是內(nèi)源性還是外源性 – 根據(jù)其分子環(huán)境改變其熒光壽命。這可能與蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)的相互作用,細(xì)胞或組織代謝狀態(tài)的影響,或參與細(xì)胞功能的離子濃度相結(jié)合。在這些應(yīng)用中,任務(wù)不是區(qū)分不同的熒光團(tuán),而是區(qū)分不同分子環(huán)境中相同熒光團(tuán)的組分,并通過(guò)其相對(duì)濃度量化它們,參考文獻(xiàn)[1,4,15]。在大多數(shù)情況下,這需要記錄多指數(shù)衰減函數(shù),并將它們分成不同的衰減分量。因此,多指數(shù)衰減記錄和多指數(shù)衰減分析是生物系統(tǒng)的FLIM標(biāo)準(zhǔn)配置。圖 25 和圖 26 顯示了幾個(gè)示例。圖30、圖31和圖38顯示了多指數(shù)FLIM測(cè)量的更多示例。

圖25:頂部:人體視網(wǎng)膜的FLIM圖像,在體記錄。快速、中衰減和慢衰減分量的強(qiáng)度貢獻(xiàn)。底部:圖像選定點(diǎn)的衰減曲線。數(shù)據(jù)由耶拿大學(xué)的Dietrich Schweitzer和Martin Hammer提供。

圖26:通過(guò)FLIM對(duì)NADH(左)和FAD(右)進(jìn)行代謝成像。雙指數(shù)衰減的振幅加權(quán)壽命(tm)、和快速衰減分量振幅a1的圖像。底部:NADH和FAD圖像的選定點(diǎn)中的衰減函數(shù)。
從多指數(shù)衰減分析中提取單個(gè)衰減分量比單指數(shù)擬合或一階矩分析需要更多的光子,參考文獻(xiàn)[17]。因此,探測(cè)效率和光子效率是關(guān)鍵參數(shù)。時(shí)間分辨率也很重要 – 對(duì)IRF寬度的要求是由最快衰減分量的壽命決定的,而不是由凈衰減函數(shù)的表觀壽命決定的。
同樣重要的是衰減函數(shù)的形狀,它們與單指數(shù)衰減的差異越大越好。具有幾乎相同壽命的衰減分量很難或不可能分裂,參考文獻(xiàn)[17],低振幅的衰減分量也很難提取。圖 27 顯示了三個(gè)示例。左圖所示的函數(shù)在 2.4 ns 的背景中包含 445 ns 的 82 %。這很容易解決。中間的函數(shù)比較困難。快速分量的幅度僅為24%,壽命值接近900 ps,而慢速分量的幅度為2.5 ns。凈衰減函數(shù)比左邊的函數(shù)更接近單指數(shù)。右側(cè)的衰減輪廓在視覺(jué)上與單指數(shù)衰減無(wú)法區(qū)分。它包含35%的3 ns和65%的4.5 ns,使用FLIM中通常可用的光子數(shù)量,無(wú)法逐個(gè)像素地解析。

圖 27:雙指數(shù)衰減函數(shù)。左側(cè)的函數(shù)易于解析,中間的函數(shù)難以解析,右側(cè)的函數(shù)在FLIM數(shù)據(jù)中幾乎不可能解析。
圖27右所示的情況,如果可能的話,應(yīng)該在實(shí)驗(yàn)計(jì)劃中避免。一個(gè)例子是FRET實(shí)驗(yàn):具有大供體 – 受體重疊的FRET對(duì),和具有短供體 – 受體距離和大比例供體相互作用的FRET結(jié)構(gòu),以大振幅和短壽命提供供體衰減函數(shù)的快速分量。這使得衰減輪廓更容易分辨,從而分離相互作用和非相互作用的供體部分。在某些情況下,如果信號(hào)利用光譜進(jìn)一步分離,結(jié)果可以得到極大的改善。衰減分量的數(shù)量得以減少,分析變得更加容易。光譜分離可以在激發(fā)端和探測(cè)端獲得。一個(gè)例子是NADH / FAD FLIM的代謝成像。當(dāng)兩個(gè)熒光團(tuán)以相同的波長(zhǎng)激發(fā)(正如經(jīng)常嘗試的那樣)并且僅通過(guò)不同的發(fā)射濾光片觀察到時(shí),這種情況幾乎是無(wú)望的。然而,通過(guò)在正確的波長(zhǎng)間隔內(nèi)進(jìn)行多路復(fù)用激發(fā)和探測(cè),信號(hào)可以很好地分離,參考文獻(xiàn)[15]。因此,在樣品設(shè)計(jì)和FLIM配置方面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)規(guī)劃對(duì)結(jié)果的質(zhì)量有很大的影響。
圖28和圖29給出了多指數(shù)衰減測(cè)量的示例。圖28顯示了NADH溶液的FLIM數(shù)據(jù)。使用溶液獲得在整個(gè)掃描區(qū)域均勻的壽命分布。然后,像素上的參數(shù)直方圖由光子噪聲決定,而不是由掃描區(qū)域的壽命變化決定。在785 nm處用雙光子激發(fā)記錄數(shù)據(jù),用512 x 512像素,1024個(gè)時(shí)間通道掃描圖像。從上到下,圖28顯示了使用H7422-40 PMT探測(cè)器以及HPM-100-40和HPM-100-06混合探測(cè)器記錄的數(shù)據(jù)。IRF 寬度分別為 250 ps、110 ps 和 18 ps。從左到右,該圖顯示了任意選定點(diǎn)的衰減曲線、快速分量 t1 的壽命直方圖、第二快分量 t2 的直方圖和慢分量 t3 的直方圖。
可以清楚地看到,隨著IRF寬度的減小,壽命直方圖變得更窄。有趣的是,這不僅適用于快速分量,也適用于中慢分量。使用 HPM-100-06 獲得最佳結(jié)果,即 IRF 寬度為 18 ps。使用如此快速的IRF記錄的衰減數(shù)據(jù)幾乎不受IRF引起的計(jì)時(shí)抖動(dòng)的影響。HPM-100-06的t1、t2 和 t3 的直方圖比 H7422 窄 1.4 倍,這意味著它的光子效率高出2倍。
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圖28:NADH溶液,用不同探測(cè)器記錄的數(shù)據(jù)。上排:H7422-40探測(cè)器,IRF寬度250 ps。第二排:HPM-100-40,IRF 寬度 110 ps。下排:HPM-100-06,IRF 寬度 18 ps。從左到右:任意選定點(diǎn)的衰減曲線,快速分量的直方圖,t1,第二快分量的直方圖,t2,慢分量的直方圖,t3。雙光子激發(fā),非解掃描探測(cè),圖像512×512像素,1024個(gè)時(shí)間通道,約5000個(gè)光子在合并區(qū)域里。
圖29給出了對(duì)壽命低于25ps的超快衰減分量探測(cè)的示例。這種快速分量很常見(jiàn),我們經(jīng)常在人類的頭發(fā),蘑菇孢子和哺乳動(dòng)物皮膚的痣中發(fā)現(xiàn)它們。在黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的熒光衰減中也存在一種快速分量,F(xiàn)AD是一種存在于每個(gè)細(xì)胞中的天然熒光團(tuán)。FAD很重要,因?yàn)樗臒晒馑p函數(shù)包含有關(guān)細(xì)胞代謝狀態(tài)的信息。
圖29顯示了FAD溶液的FLIM圖像。從左到右,該圖顯示了快速衰減分量 t1、三重指數(shù)擬合的衰減曲線和 t1 直方圖的圖像。上行的數(shù)據(jù)用HPM-100-40探測(cè)器記錄,下排的數(shù)據(jù)用HPM-100-06記錄。從視覺(jué)上看,HPM-100-40(IRF 110 ps FWHM)記錄的衰減曲線沒(méi)有顯示出快速分量的痕跡。但是,仔細(xì)的數(shù)據(jù)分析會(huì)提取一個(gè)使用壽命約為20 ps的分量。除非明確搜索,否則不易發(fā)現(xiàn)。整個(gè)圖像上 t1 值的直方圖顯示在右側(cè)。
用HPM-100-06(IRF寬度18 ps FWHM)記錄的數(shù)據(jù)。衰減曲線令人信服地表明,快速分量確實(shí)存在。在圖像的選定位置進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,最快的分量的壽命為16.5 ps(其他兩個(gè)分量分別為2.2 ns和3.2 ns)。直方圖顯示最常見(jiàn)的 t1 值約為 16 ps。
正如對(duì)快速IRF所預(yù)期的那樣,直方圖比HPM-100-40的數(shù)據(jù)窄了近2倍。

圖29:FAD溶液的熒光。從左到右:快速衰減分量t1的圖像,三重指數(shù)分析的衰減曲線,t1的直方圖。上排:用 HPM-100-40 探測(cè)器記錄,IRF 寬度 110 ps FWHM。下排:使用 HPM-100-06 探測(cè),IRF 寬度 18 ps FWHM。
應(yīng)該注意的是,探測(cè)器的IRF寬度與探測(cè)效率之間存在潛在的取舍。快速探測(cè)器具有傳統(tǒng)的雙堿光陰極,因此,它們的靈敏度比GaAsP探測(cè)器低約4倍,但沒(méi)法知道更快的IRF和更高的靈敏度誰(shuí)更重要。當(dāng)然,為了解析超快衰減分量,沒(méi)有辦法繞過(guò)快速IRF,無(wú)論您是實(shí)際看到快速分量還是必須通過(guò)反卷積將其從數(shù)據(jù)中擠出。我們還發(fā)現(xiàn),使用低于20ps的IRF對(duì)NADH和FAD數(shù)據(jù)的雙指數(shù)和三指數(shù)衰減分析更可靠,參考文獻(xiàn)[2,13],這也可以在圖28的底部看到。在實(shí)踐中,探測(cè)器的選擇取決于樣品的光穩(wěn)定性。如果樣品在四倍的激發(fā)功率下或四倍的采集時(shí)間內(nèi)依然保持穩(wěn)定,則選擇快速IRF的探測(cè)器。反之,則必須使用GaAsP探測(cè)器。
1. W. Becker, Advanced time-correlated single-photon counting techniques. Springer, Berlin, Heidelberg, New York,2005
2. W. Becker, The bh TCSPC handbook, 8th edition. Becker & Hickl GmbH (2019), available online on www.becker-hickl.com. Please contact bh for printed copies.
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4. W. Becker (ed.), Advanced time-correlated single photon counting applications. Springer, Berlin, Heidelberg, New York (2015)
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6. Becker & Hickl GmbH, Modular FLIM systems for Zeiss LSM 510 and LSM 710 family laser scanning microscopes.?User handbook. Available on www.becker-hickl.com
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8. Fast-Acquisition TCSPC FLIM: What are the Options? Application note, available from www.becker-hickl.com
9. W. Becker, V. Shcheslavkiy, S. Frere, I. Slutsky, Spatially Resolved Recording of Transient Fluorescence-Lifetime?Effects by Line-Scanning TCSPC. Microsc. Res. Techn. 77, 216-224 (2014)
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11. W. Becker, B. Su, K. Weisshart, O. Holub, FLIM and FCS Detection in Laser-Scanning Microscopes: Increased?Efficiency by GaAsP Hybrid Detectors. Micr. Res. Tech. 74, 804-811 (2011)
12. Wolfgang Becker, Cornelia Junghans, Axel Bergmann, Two-photon FLIM of mushroom spores reveals ultra-fast decay component. Application note, available on www.becker-hickl.com.
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14. Becker & Hickl GmbH, Two-Photon FLIM with a Femtosecond Fibre Laser. Application note, www.becker-hickl.com
15. Becker Wolfgang, Suarez-Ibarrola Rodrigo, Miernik Arkadiusz, Braun Lukas, Metabolic Imaging by Simultaneous?FLIM of NAD(P)H and FAD. Current Directions in Biomedical Engineering 5(1), 1-3 (2019)
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翻譯 by 譚瓅
摘要:這篇文章試圖幫助bh FLIM技術(shù)的現(xiàn)有和未來(lái)用戶從FLIM實(shí)驗(yàn)中獲得最佳結(jié)果。第一部分解釋了TCSPC FLIM的原理,并給出了記錄的光子分布的效果。它表明,測(cè)量壽命的信噪比在優(yōu)先取決于記錄的光子數(shù)量。第二部分重點(diǎn)介紹優(yōu)化光子數(shù),而不增加施加到樣品中的光應(yīng)力。我們討論了激發(fā)功率、采集時(shí)間、采集效率、數(shù)值孔徑、聚焦精度、對(duì)準(zhǔn)精度和探測(cè)器效率的影響。第三部分將重點(diǎn)介紹光子效率。它考慮了TCSPC計(jì)時(shí)參數(shù)、計(jì)數(shù)背景、像素?cái)?shù)、儀器響應(yīng)函數(shù)的影響,以及多指數(shù)衰減函數(shù)的挑戰(zhàn)。最后一部分專門介紹數(shù)據(jù)分析。本文中的所有結(jié)論均通過(guò)在實(shí)際條件下記錄的真實(shí)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行演示。
當(dāng)FLIM用戶希望增加光子數(shù)時(shí),第一個(gè)想法通常是增加激發(fā)功率。這當(dāng)然是獲得更多光子的有效方法,但它并不總是有助于獲得更好的FLIM結(jié)果。FLIM實(shí)驗(yàn)通常在熒光團(tuán)濃度低的樣品上進(jìn)行,原因是只有當(dāng)熒光團(tuán)本身對(duì)細(xì)胞的活力或其代謝功能沒(méi)有明顯影響時(shí),才能看到分子效應(yīng)。此外,熒光團(tuán)可能具有較低的量子效率。如果增加激發(fā)功率,分子必須執(zhí)行更多的激發(fā)–發(fā)射循環(huán),結(jié)果是光漂白,形成自由基,激光誘導(dǎo)壽命變化,光損傷,甚至樣品完全被破壞。然后,成像過(guò)程不再是非侵入性的,FLIM結(jié)果變得毫無(wú)意義。因此,增加激光功率的選擇是有限的(參考文獻(xiàn)[8])。侵入性效應(yīng)的幾個(gè)例子如圖8所示。

圖8:左:Convallaria圖像,用405nm激光掃描的中心區(qū)域。中:活細(xì)胞的雙光子NADH圖像。在明亮的紅色斑點(diǎn)中,發(fā)生了光損傷,通過(guò)非常快速衰減的斑點(diǎn)表現(xiàn)出來(lái)。右圖:酵母細(xì)胞的時(shí)域馬賽克拼接FLIM圖像,采用780nm雙光子激發(fā)。記錄從左下角開(kāi)始,一直到拼接圖的右上角。破壞從第8和9格開(kāi)始,一直持續(xù)到第16格。
與增加激發(fā)功率不同,增加采集時(shí)間通常是一種不錯(cuò)的選擇,損傷效果是高度非線性的。通常,可以用僅略低于損傷閾值的功率長(zhǎng)時(shí)間掃描樣品,可增加光子數(shù),所需要的只是實(shí)驗(yàn)者的耐心。圖 9 顯示了一個(gè)示例。左邊的圖像采集時(shí)間為1分鐘,右邊的圖像采集時(shí)間為2分鐘。結(jié)果是,右邊的圖像包含2倍以上的光子。正如預(yù)期的那樣,它還提供了1.4倍的壽命SNR,參考圖像下方的壽命直方圖。

圖9:以不同的采集時(shí)間對(duì)同一樣品進(jìn)行成像,左圖 1 分鐘,右圖2 分鐘。圖像格式512×512像素,1024個(gè)時(shí)間通道。
雖然光子數(shù)(以及壽命精度)和采集時(shí)間的相關(guān)性是微不足道的,但FLIM用戶通常不會(huì)意識(shí)到這一點(diǎn)。特別是來(lái)自傳統(tǒng)基于強(qiáng)度的成像的用戶,當(dāng)達(dá)到強(qiáng)度圖像的合理SNR時(shí),往往會(huì)停止采集。但是,這存在一個(gè)謬誤。當(dāng)強(qiáng)度圖像每像素包含不超過(guò)幾十個(gè)光子時(shí),它開(kāi)始看起來(lái)不錯(cuò)。這種圖像的SNR可能足以區(qū)分不同的熒光團(tuán),但不足以從熒光壽命中得出所需的分子信息。因此,請(qǐng)確保采集時(shí)間足夠長(zhǎng)。我們的SPCM采集軟件提供了許多選項(xiàng),用于在采集過(guò)程中查看光子數(shù)。您可以在所選像素或感興趣區(qū)域中顯示衰減曲線,可以在最亮的像素和所選像素中顯示光子數(shù),并且可以在線顯示壽命圖像。請(qǐng)參見(jiàn)圖 10,使用這些選項(xiàng),您應(yīng)該能確定到目前為止記錄的數(shù)據(jù)是否足以進(jìn)行進(jìn)一步分析。如有不夠,請(qǐng)記錄更長(zhǎng)時(shí)間。

圖10:SPCM幫助用戶確定是否記錄了足夠光子數(shù)的功能。從左到右:在線壽命圖像,選定位置的衰減曲線,最亮像素(頂部)中的光子數(shù)和數(shù)據(jù)點(diǎn)位置的光子數(shù)。
有時(shí)有人反對(duì)說(shuō),當(dāng)要觀察生理變化時(shí),無(wú)法采用較長(zhǎng)的采集時(shí)間。然而,如果使用適當(dāng)?shù)亩嗑STCSPC技術(shù),這并不一定,請(qǐng)看(參考文獻(xiàn)[2,9])。
顯微鏡物鏡的數(shù)值孔徑對(duì)探測(cè)效率有顯著影響。熒光以各向同性方式發(fā)射,只有一部分被顯微物鏡收集。從理論上講,收集效率隨著數(shù)值孔徑的增加而成平方倍增加。這意味著NA 1.25的物鏡應(yīng)該比NA 0.5的物鏡收集6倍以上的光子數(shù)。但在實(shí)踐中,差異會(huì)小一些,因?yàn)楦邤?shù)值孔徑物鏡具有更多的光學(xué)元件和更低的透過(guò)率。然而,收集效率的差異是驚人的。圖 11 顯示了一個(gè)示例。兩幅圖像都采用單光子激發(fā)和共聚焦探測(cè)記錄的。左圖像用NA 0.5的x20空氣鏡記錄,右圖像用NA 1.25的x63油鏡記錄。使用高數(shù)值孔徑物鏡記錄的圖像包含的光子是低數(shù)值孔徑下記錄的圖像的三倍。

圖11:使用不同NA的物鏡記錄的FLIM圖像,相同的強(qiáng)度尺度,單光子激發(fā),共聚焦探測(cè)。左:X20 空氣鏡,NA 0.5,右:X63油鏡,NA 1.25.
對(duì)焦不佳通常被認(rèn)為是空間分辨率欠佳的來(lái)源,同時(shí),它對(duì)探測(cè)效率也有顯著影響。圖 12 顯示了一個(gè)示例,兩幅圖像均通過(guò)共聚焦掃描記錄,針孔尺寸相同,采集時(shí)間相同。左圖略微失焦,盡管如此,圖像清晰度只是略受損。右圖完全對(duì)焦。可以很容易地看出,正確對(duì)焦的圖像更亮。與失焦圖像相比,光子的數(shù)量大約高出1.5倍。由于FLIM系統(tǒng)顯示強(qiáng)度歸一化圖像(這樣做是因?yàn)閺?qiáng)度的差異可能時(shí)數(shù)量級(jí)的),因此通常不會(huì)注意到這些差異。因此,當(dāng)您在“預(yù)覽”模式下進(jìn)行最終對(duì)焦時(shí),請(qǐng)花幾秒鐘在關(guān)閉自動(dòng)縮放功能的情況下優(yōu)化對(duì)焦。

圖 12:左圖略微失焦,右圖完全對(duì)焦。相同強(qiáng)度尺度,單光子激發(fā),共聚焦探測(cè)。雖然失焦圖像中的圖像清晰度僅略受損,但光子數(shù)僅為完美圖像中光子數(shù)的60%。圖像格式512 x 512像素,1024個(gè)時(shí)間通道。
光學(xué)系統(tǒng)的對(duì)準(zhǔn)對(duì)探測(cè)效率有巨大的影響,共聚焦系統(tǒng)尤其如此。共聚焦對(duì)準(zhǔn)非常關(guān)鍵,幾乎沒(méi)有一個(gè)共聚焦系統(tǒng)可以長(zhǎng)時(shí)間保持完美對(duì)準(zhǔn)。圖 13 顯示了一個(gè)示例,左邊的圖像是在針孔對(duì)準(zhǔn)稍微偏離的情況下采集的,幾乎在任何共聚焦系統(tǒng)中都可以發(fā)現(xiàn)這樣水平的失準(zhǔn)。通常,它不被注意到,因?yàn)閳D像清晰度幾乎沒(méi)有受到損害。然而,與來(lái)自完美對(duì)準(zhǔn)系統(tǒng)的圖像進(jìn)行比較(圖13,右),記錄的光子數(shù)量存在明顯的損失。某些情況的失準(zhǔn)甚至導(dǎo)致圖像清晰度可見(jiàn)的下降,可導(dǎo)致光子數(shù)的巨大損失,在這些情況下,效率下降一個(gè)數(shù)量級(jí)甚至更多并不罕見(jiàn)。

圖 13:共聚焦對(duì)準(zhǔn)的效果。左:略微失準(zhǔn)。右:完美對(duì)準(zhǔn)。雖然不對(duì)準(zhǔn)尚未導(dǎo)致圖像清晰度的可見(jiàn)下降,但它會(huì)導(dǎo)致50%的光子損失。
在非解掃探測(cè)(NDD)的多光子系統(tǒng)中,失準(zhǔn)甚至也可能導(dǎo)致影響。雖然這些系統(tǒng)的探測(cè)光路很可靠,很少失準(zhǔn),但激發(fā)光路卻存在失準(zhǔn)的可能。多光子顯微鏡的飛秒激光需要空間光耦合到掃描頭中,這為光路提供了許多可能偏離對(duì)準(zhǔn)的可能,這導(dǎo)致激光不再集中在顯微物鏡的后孔徑中間。結(jié)果,聚焦質(zhì)量下降,激發(fā)效率降低,光漂白和光損傷并不總是以相同的比例減少,特別是如果樣品在激光的本身的波長(zhǎng)上有一定的吸收。因此,多光子系統(tǒng)也應(yīng)該定期重新對(duì)準(zhǔn)。這可以通過(guò)檢查激光束在物鏡后孔徑上的位置,并將其調(diào)回中心來(lái)輕松完成。
多年來(lái),激光掃描顯微鏡,特別是FLIM系統(tǒng),一直使用傳統(tǒng)的光電倍增管(PMT)作為探測(cè)器。PMT具有較大的有效面積,每平方毫米有效面積的暗計(jì)數(shù)率極低,并且有足夠的增益和速度來(lái)探測(cè)單個(gè)光子。具有常規(guī)光陰極的PMT的光陰極的量子效率約為20%,然而,并非每個(gè)由陰極發(fā)射的光電子都進(jìn)入放大系統(tǒng)并提供有用的單電子脈沖。因此,凈效率約為15%。隨著采用帶有GaAsP陰極的PMT,效率有所提高,這些陰極的量子效率接近50%。如濱松的H7422 GaAsP PMT,已經(jīng)用于FLIM多年。然而,這些探測(cè)器的儀器響應(yīng)(IRF)寬度約為250至350 ps,這對(duì)于高端FLIM應(yīng)用來(lái)說(shuō)是不夠的。隨著濱松R10467-40混合型PMT的推出,情況完全改變了,混合型PMT的原理保證了幾乎所有離開(kāi)陰極的光電子都能提供單電子脈沖。憑借其GaAsP光電陰極,R10467-40的凈探測(cè)效率達(dá)到50%。IRF快速而干凈,并且沒(méi)有像傳統(tǒng)PMT那樣的后脈沖背景。但R10467-40不易使用,它需要 -8000 V 和 +400 V 電源電壓、可靠的過(guò)載保護(hù)、高增益前置放大器和出色的射頻屏蔽。bh是第一個(gè)解決這些問(wèn)題的公司,并將這種探測(cè)器完全應(yīng)用到其FLIM系統(tǒng)(參考文獻(xiàn)[11])。不同探測(cè)器效率的比較可以在“bh TCSPC手冊(cè)”(參考文獻(xiàn)[2])的“TCSPC探測(cè)器”一章中找到。
圖 14 顯示了一個(gè)實(shí)際示例。左邊的圖像是用傳統(tǒng)的PMT(bh PMC-100-0模塊)記錄的,右邊的圖像是用GaAsP混合型PMT(bh HPM-100-40模塊)記錄的。采用GaAsP混合探測(cè)器的光子數(shù)約為4.2倍。

圖 14:使用傳統(tǒng) PMT(bh PMC-100-0,左)和混合型 PMT(bh HPM-100-40,右)記錄的 FLIM 圖像。相同的成像條件,相同的采集時(shí)間。HPM-100-40圖像包含的光子是使用傳統(tǒng)PMT拍攝的圖像的4.2倍。
獲得的壽命的SNR與每個(gè)像素的光子數(shù)成正比。因此,原則上,光子限制條件下的SNR可以通過(guò)減少像素?cái)?shù)量來(lái)增加。例如,128 x 128 像素的圖像只需要 512 x 512 像素圖像的 1/16 光子。這種方法的缺陷在于,它用壽命精度與空間分辨率進(jìn)行了權(quán)衡。除非有其他使用低像素?cái)?shù)的必要(例如限制的數(shù)據(jù)大小或需要快速掃描),否則不建議將像素?cái)?shù)降低到256 x 256 以下。更好的方法是使用足夠空間采樣的像素?cái)?shù)記錄圖像,而在數(shù)據(jù)分析中使用像素合并(參考文獻(xiàn)[3]),有關(guān)詳細(xì)信息,請(qǐng)參閱第四部分——“數(shù)據(jù)分析”。數(shù)據(jù)分析中的像素合并使像素?cái)?shù)保持不變,但會(huì)對(duì)當(dāng)前像素及其周圍像素的衰減數(shù)據(jù)之和運(yùn)行壽命分析。
其優(yōu)點(diǎn)是空間分辨率沒(méi)有損失,也沒(méi)有空間欠采樣,并且您可以自由地在記錄的數(shù)據(jù)上選擇最佳的像素合并因子。圖 15 顯示了一個(gè)示例。頂行的數(shù)據(jù)以128 x 128像素掃描記錄,底行的數(shù)據(jù)通過(guò)512 x 512像素掃描記錄,兩個(gè)記錄都包含相同的光子總數(shù)。因此,512 x 512 像素掃描的每像素光子數(shù)要低 16 倍。然而,較低的光子數(shù)可通過(guò)數(shù)據(jù)分析軟件中的像素合并來(lái)補(bǔ)償?shù)摹R虼耍總€(gè)合并區(qū)域(底行)的衰減曲線包含與每個(gè)像素衰減曲線(頂行)相同的光子數(shù)。因此,兩個(gè)記錄的壽命直方圖(如右圖所示)具有相同的寬度。但是,來(lái)自512 x 512像素掃描的圖像(底行,左)比來(lái)自128 x 128像素掃描的圖像(頂行,左)清晰得多。請(qǐng)參閱“數(shù)據(jù)分析”部分。

圖 15:使用不同像素?cái)?shù)記錄的 FLIM 數(shù)據(jù)。相同的采集時(shí)間,相同的光子總數(shù),上行128 x 128 像素,下行 512 x 512 像素。從左到右:圖像、光標(biāo)位置的衰減曲線、壽命直方圖。使用像素合并對(duì)512 x 512像素的圖像進(jìn)行分析,以補(bǔ)償每像素的較低光子數(shù)。
1. W. Becker, Advanced time-correlated single-photon counting techniques. Springer, Berlin, Heidelberg, New York,2005
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15. Becker Wolfgang, Suarez-Ibarrola Rodrigo, Miernik Arkadiusz, Braun Lukas, Metabolic Imaging by Simultaneous?FLIM of NAD(P)H and FAD. Current Directions in Biomedical Engineering 5(1), 1-3 (2019)
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17. M. K?llner, J. Wolfrum, How many photons are necessary for fluorescence-lifetime measurements?, Phys. Chem. Lett.?200, 199-204 (1992)
18. I. Isenberg, R.D. Dyson, The analysis of fluorescence decay by a method of moments. Biophys. J. 9, 1337-1350 (1969)
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翻譯 by 譚瓅
摘要:這篇文章試圖幫助bh FLIM技術(shù)的現(xiàn)有和未來(lái)用戶從FLIM實(shí)驗(yàn)中獲得最佳結(jié)果。第一部分解釋了TCSPC FLIM的原理,并給出了記錄的光子分布的效果。它表明,測(cè)量壽命的信噪比在優(yōu)先取決于記錄的光子數(shù)量。第二部分重點(diǎn)介紹優(yōu)化光子數(shù),而不增加施加到樣品中的光應(yīng)力。我們討論了激發(fā)功率、采集時(shí)間、采集效率、數(shù)值孔徑、聚焦精度、對(duì)準(zhǔn)精度和探測(cè)器效率的影響。第三部分將重點(diǎn)介紹光子效率。它考慮了TCSPC計(jì)時(shí)參數(shù)、計(jì)數(shù)背景、像素?cái)?shù)、儀器響應(yīng)函數(shù)的影響,以及多指數(shù)衰減函數(shù)的挑戰(zhàn)。最后一部分專門介紹數(shù)據(jù)分析。本文中的所有結(jié)論均通過(guò)在實(shí)際條件下記錄的真實(shí)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行演示。

圖1:BPAE樣品的FLIM圖像,2048 x 2048像素,衰減函數(shù)記錄在256個(gè)時(shí)間通道中。采用bh DCS-120 共聚焦 FLIM 系統(tǒng),bh SPCImage FLIM 數(shù)據(jù)分析軟件。
是什么造就了一個(gè)好的FLIM圖像?它應(yīng)該具有完美的空間分辨率、足夠高的像素?cái)?shù)、高對(duì)比度、低背景噪聲,沒(méi)有失焦模糊,并且它應(yīng)該以高信噪比顯示熒光壽命。如上圖所示。有經(jīng)驗(yàn)的FLIM用戶可能會(huì)補(bǔ)充說(shuō),僅僅記錄熒光壽命是不夠的,整個(gè)衰減函數(shù)應(yīng)該記錄在每個(gè)像素中。
為什么發(fā)表在科學(xué)論文中的FLIM圖像很少看起來(lái)像上面的圖像?這實(shí)際上沒(méi)有任何理由。所有要做的就是使用完美對(duì)準(zhǔn)的光學(xué)元件,正確的顯微物鏡,完美的聚焦,正確的激發(fā)和探測(cè)波長(zhǎng),正確的探測(cè)器以及一點(diǎn)點(diǎn)耐心。對(duì)FLIM的信號(hào)處理原理的一些理解也可能有所幫助,這些是每個(gè)FLIM用戶都可以實(shí)現(xiàn)的。
本文介紹了獲得出色的 FLIM 結(jié)果的重要因素,給出的大多數(shù)建議都是微不足道的。然而,差之毫厘,失之千里,正是這些瑣碎事物的總和,使得完美的FLIM結(jié)果區(qū)別于平庸的FLIM結(jié)果。
追求完美FLIM結(jié)果的道路始于理解TCSPC FLIM結(jié)果是光子的分布,參考文獻(xiàn)[1]。記錄過(guò)程的基本原理如圖2所示。
通過(guò)高頻脈沖激光束掃描樣品,探測(cè)器探測(cè)發(fā)射的熒光單光子,并由TCSPC系統(tǒng)測(cè)量激光脈沖周期內(nèi)每個(gè)光子的到達(dá)時(shí)間t。同時(shí),TCSPC系統(tǒng)確定激光束在光子探測(cè)時(shí)刻的空間坐標(biāo)x,y。從這些數(shù)據(jù)中,光子在空間坐標(biāo)上和時(shí)間上的分布被建立起來(lái)。這種光子分布是期望的壽命圖像:它是x*y像素的數(shù)據(jù)陣列,每個(gè)像素都包含大量連續(xù)時(shí)間通道中的熒光衰減函數(shù)。參見(jiàn)圖 2右。記錄過(guò)程及其各種擴(kuò)展的詳細(xì)說(shuō)明可以在文獻(xiàn)[2]中找到。

圖2:TCSPC FLIM原理
圖3給出了FLIM記錄的光子分布的效果。該圖顯示了 8 個(gè)水平 x 128 垂直像素的圖像區(qū)域。每個(gè)像素有256個(gè)時(shí)間通道,包含該像素的衰減數(shù)據(jù)。當(dāng)然,真實(shí)的FLIM圖像具有更高的像素?cái)?shù)。常規(guī)FLIM為采用256至1024個(gè)時(shí)間通道的512 x512像素的格式,并且已經(jīng)演示過(guò)采用256個(gè)時(shí)間通道的2048 x 2048像素的格式,參考文獻(xiàn)[2]。
對(duì)于沒(méi)有經(jīng)驗(yàn)的用戶來(lái)說(shuō),圖3中所示的分布可能看起來(lái)非常“嘈雜”:?jiǎn)蝹€(gè)像素中的熒光衰減幾乎看不見(jiàn)。當(dāng)然,這些“噪聲”不是由探測(cè)器或TCSPC電子設(shè)備的任何噪聲引起的,它只是一種光子統(tǒng)計(jì)的效應(yīng),噪聲如此之高的原因是光子分布在大量的像素和時(shí)間通道上。因此,每個(gè)像素的光子數(shù)都很低,特別是在每個(gè)像素中各個(gè)時(shí)間通道中的光子數(shù)更低。那么,如何降低光子分布中的“噪聲”呢?唯一的方法是記錄更多的光子,見(jiàn)圖4。

圖3:TCSPC FLIM的光子分布。該圖表示 X × Y = 8 × 128 像素的圖像區(qū)域,每個(gè)像素有256個(gè)時(shí)間通道,每個(gè)時(shí)間通道都包含熒光衰減周期內(nèi)連續(xù)時(shí)間的光子。

圖4:與圖3所示的光子分布相同,但記錄的光子多10倍,信噪比高出3.1倍,單個(gè)像素中的熒光衰減曲線清晰突出。
從這些數(shù)據(jù)中得出的熒光壽命的信噪比是多少?我們從一個(gè)簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)中獲得答案。
根據(jù)定義,熒光壽命τ是分子保持在激發(fā)態(tài)的平均時(shí)間。當(dāng)一個(gè)分子發(fā)出一個(gè)光子時(shí),這意味著它從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)。FLIM系統(tǒng)探測(cè)單個(gè)光子并測(cè)量它們相對(duì)于激發(fā)脈沖的時(shí)間t,如圖5 a和b。當(dāng)FLIM系統(tǒng)探測(cè)到大量這樣的光子時(shí),它們?cè)诩ぐl(fā)脈沖后到達(dá)探測(cè)器的平均時(shí)間是分子處于激發(fā)態(tài)的平均時(shí)間,即為熒光壽命,見(jiàn)圖5 c。雖然FLIM硬件通常不直接計(jì)算平均到達(dá)時(shí)間,但它存在于光子分布中。

圖5,a和b:光子的探測(cè)和激發(fā)后一段時(shí)間(t)內(nèi)光子隨時(shí)間的分布. c:探測(cè)N光子后的光子分布,激發(fā)后的平均到達(dá)時(shí)間<t>是熒光壽命τ. d:到達(dá)時(shí)間(t)的標(biāo)準(zhǔn)差σt,是熒光壽命τ。平均到達(dá)時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)差 στ 為 τ /SQRT(N).
平均到達(dá)時(shí)間的信噪比是多少?單個(gè)光子到達(dá)時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)偏差στ與熒光壽命τ本身相同,這是指數(shù)函數(shù)的性質(zhì)。如果我們平均大量( N 個(gè))光子的到達(dá)時(shí)間,則結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差στ隨N的平方根而減小,請(qǐng)參見(jiàn)圖5,d。因此,探測(cè)到N個(gè)光子后的信噪比,即τ除以其標(biāo)準(zhǔn)偏差στ的比值為:
SNRτ = τ / στ = SQRT (N)
這意味著可以獲得熒光壽命的標(biāo)準(zhǔn)偏差只是衰減曲線中光子數(shù)量的平方根,參考文獻(xiàn)[17],這在幾個(gè)方面是一個(gè)了不起的結(jié)果。首先,像素壽命的信噪比與像素強(qiáng)度的信噪比相同,這否定了FLIM比穩(wěn)態(tài)成像需要更多的光子(因此需要更多的采集時(shí)間)的普遍觀點(diǎn)。其次,信噪比僅取決于N,特別是,不依賴于記錄熒光衰減的時(shí)間通道數(shù)。換句話說(shuō),您可以增加時(shí)間通道的數(shù)量,以提高時(shí)間分辨率或減少采樣偽影,而不會(huì)影響信噪比。第三,由于SNR僅依賴于N,因此提高壽命精度的唯一方法是增加N。這意味著你要么必須減少像素的數(shù)量 – 你通常不希望 – 或者記錄更多的光子。記錄更多光子是獲得良好FLIM結(jié)果的關(guān)鍵,也是下一部分的主題。
如上所述,單指數(shù)衰減(或單指數(shù)衰減近似)的熒光壽命可以通過(guò)計(jì)算光子的平均到達(dá)時(shí)間來(lái)獲得。如果光子的單個(gè)到達(dá)時(shí)間不可用,則可以通過(guò)從完整的光子分布中計(jì)算“一階矩” M1 (參考文獻(xiàn)[18])獲得平均到達(dá)時(shí)間:

上述等式中的時(shí)間t,是光子在FLIM系統(tǒng)的觀測(cè)時(shí)間間隔內(nèi)的時(shí)間,而不是從激發(fā)脈沖之后的時(shí)間。因此,必須減去激發(fā)時(shí)間(在實(shí)踐中是IRF的一階矩)才能得到熒光壽命τ:
τ = M1fluorescence ?M1IRF
該方法如圖2所示。藍(lán)點(diǎn)是各個(gè)時(shí)間通道中的光子數(shù),綠色曲線是IRF,紅色曲線是通過(guò)用IRF卷積指數(shù)函數(shù)e-t/τ來(lái)計(jì)算的假設(shè)熒光衰減函數(shù)。

圖6:熒光壽命的一階矩計(jì)算,熒光壽命是熒光的一階矩和IRF的一階矩的差值。
一階矩技術(shù)以理想的信噪比提供單指數(shù)衰減的時(shí)間。但是,它不會(huì)提供多指數(shù)衰減函數(shù)的參數(shù),并且如果記錄包含背景計(jì)數(shù),或只有一部分衰減函數(shù)位于TCSPC系統(tǒng)的觀測(cè)時(shí)間間隔內(nèi),則它不會(huì)提供正確的衰減時(shí)間。因此,它幾乎完全被曲線擬合技術(shù)所取代。然而,一階矩技術(shù)有其優(yōu)點(diǎn):它可在非常低的光子數(shù)下可靠地工作,適用于在線FLIM應(yīng)用中的快速壽命測(cè)定,最重要的是,它提供了一種在理想和非理想條件下估計(jì)FLIM信噪比的方法。我們將在本文的后面部分使用到此方法。
SQRT(N)關(guān)系的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證如圖7所示。以不同的采集時(shí)間掃描染料溶液,以獲得每像素包含約200,1600和9000個(gè)光子的FLIM圖像。典型的衰減曲線如圖7的頂行所示。第二行顯示了單個(gè)像素中熒光壽命的直方圖,它是用一階矩分析獲得的,στ 值和σ/τ = SNR 值在直方圖中顯示。從這些值可以看出,σ/τ確實(shí)非常接近于SQRT(N)。圖 7 的底行顯示了通過(guò) MLE(最大似然估計(jì))擬合獲得的壽命直方圖。從MLE擬合獲得的壽命直方圖比從矩分析中獲得的直方圖要寬一些,而且MLE結(jié)果也接近SQRT(N)的理想信噪比。

圖 7:SQRT (N) 關(guān)系的驗(yàn)證。頂行:來(lái)自羅丹明110染料溶液的FLIM數(shù)據(jù)單個(gè)像素的衰減曲線。從左到右:N = 200個(gè)光子,N = 1600個(gè)光子,N = 9000個(gè)光子。第二行:通過(guò)一階矩方法分析獲得的壽命直方圖。底行:通過(guò) MLE 分析獲得的壽命直方圖。
探測(cè)到光子并不一定意味著它有效地有助于壽命測(cè)量的準(zhǔn)確性。它可能因TCSPC模塊中不適宜地選擇的計(jì)時(shí)參數(shù)而丟失,其探測(cè)時(shí)間可能因探測(cè)器傳輸時(shí)間的不確定性而受損,或者可能存在來(lái)自背景信號(hào)的光子給光子分布增加額外的噪聲。在所有這些情況下,獲得的壽命的SNR都小于理想值SQRT(N)。這種情況可以用“光子效率”E來(lái)描述。E的倒數(shù)表示與理想系統(tǒng)相比,非理想系統(tǒng)需要多少光子才能達(dá)到相同的信噪比。由于SNR與光子數(shù)的平方根成比例,光子效率也可以寫為
E = (SNRreal / SNRideal)2
光子效率E是“品質(zhì)因數(shù)”的平方,有時(shí)用于比較不同壽命測(cè)量技術(shù)的效率(參考文獻(xiàn)[10,16])。正確配置的TCSPC系統(tǒng)在最佳條件下工作,其光子效率接近1,達(dá)到理想的光子效率將是“最大化光子效率”這一部分的主題。
1. W. Becker, Advanced time-correlated single-photon counting techniques. Springer, Berlin, Heidelberg, New York,2005
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3. SPCImage NG data analysis software. In: W. Becker, The bh TCSPC handbook, 8th edition. Becker & Hickl GmbH(2019)
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8. Fast-Acquisition TCSPC FLIM: What are the Options? Application note, available from www.becker-hickl.com
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